孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]孔鰩(Raja porosa)別名喀氏鰩，俗稱勞板魚、勞子、甫魚、鏵子魚、鍋蓋魚、虎色、夫魚、魴魚，屬于軟骨魚綱Chondrichthyes、鰩形目Rajiformes、鰩科Rajidae、鰩屬Raja的魚類。分布于北太平洋西部，中國的東海、南海及黃海、渤海均產之。
[0003]孔鰩亦為我國常見海洋藥物，全身多部位可以入藥，例如其肝味甘，性平。歸胃、肺經。具有滋補強壯，明目，止痛，健骨等功效。對治療夜盲癥，軟骨癥，干燥性眼炎，營養不良，佝僂病，久病體虛，肺結核等疾病均有療效，還用于孕婦及幼兒的滋補劑。并且具有散瘀止痛，祛風除濕，生肌斂瘡，解毒消腫之功效。主治風濕性關節炎，瘡癤，跌打腫痛，潰瘍等癥。現代研究證明，孔鰩軟骨多糖和蛋白具有顯著的生物活性，能夠很好的抑制腫瘤新生血管的生成。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠清除自由基和抑制脂質過氧化作用的孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法包括以下步驟:
1)孔鰩軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取孔鰩軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的孔鰩軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7 ?8)，于 4 °C下攪拌抽提 36 ?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min,棄殘渣收集上清液；上清液繼續在4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4 °C下透析24?48 h，透析袋內溶液即為孔鰩軟骨總蛋白粗提物。
[0006])孔鰩軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取孔鰩軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速離心20 min,取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得孔鰩軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0007])孔鰩軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取孔鰩軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比lg:3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X104U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90°C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min離心15?25 min,棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0008])孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物；將超濾酶解物次經離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0009]作為優選，所述的步驟1)中的孔鰩為孔鰩(Raja porosa)。
[0010]作為優選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得1個高活性抗氧化肽Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)，ES1-MS 測定分子量為 700.71 Da0
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10?15 μ L ;色譜柱Zorbax SB- C18 (250mmX4.6 mm, 5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(0?32min乙腈濃度由0勾速升至50%)；洗脫速度0.6-1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0012]與現有技術相比，本發明所提供的孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0014]圖2是本發明的葡聚糖凝膠Sephadex G_15層析圖。
[0015]圖3葡聚糖凝膠S印hadex G_15制備酶解物的RP-HPLC分析。
[0016]圖 4 Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly (GEEGPRG)的質譜圖。
[0017]圖5 G1 y-G 1 u-G 1 u-G 1 y-Pro-Arg-G 1 y (GEEGPRG)的抗脂質氧化能力。
【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]實施例:
一種孔鰩軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:孔鰩軟骨一軟骨總蛋白—軟骨60%丙酮沉淀蛋白一胰蛋白酶酶解一酶解物一超濾一離子交換層析一凝膠過濾層析一高效液相色譜制備一抗氧化肽。
[0020])孔鰩軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取孔鰩porosa)軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的孔鰩軟骨浸于4倍體積的1.0mol/L 鹽酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7.0)，于 4 °(:下攪拌抽提48 ho提取液在4 °C下以5000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液；上清液繼續在4 °C ,12000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μ m微孔濾膜過濾除去不溶性雜質。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4 °C下透析48h，透析袋內溶液即為孔鰩軟骨總蛋白粗提物。
[0021])孔鰩軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取孔鰩軟骨總蛋白粗提物，在冰浴下緩慢加入預冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置5 h后，于4 °C、10000 r/min高速離心20min,取上清液，加入預冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得孔鰩軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，得60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0022])孔鰩軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取孔鰩軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比lg:4mL溶于Tris-鹽酸緩沖液(0.05mol/L，pH 8.0)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9父1041]/^)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 °C ,12000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液