膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白工程技術領域，具體涉及一種膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方 法。
【背景技術】
[0002] 膠原蛋白又稱膠原，是胞外基質中的基本蛋白成分，廣泛分布于人體各個器官和 組織，如皮膚，血管、骨骼和軟骨等，尤其在人體的皮膚和結締組織中，含有大量的膠原蛋 白，皮膚細胞外基質中約70 % -80 %為膠原蛋白，其在人體的總含量約占人體蛋白質總量的 25%-33%，這些蛋白質對維護細胞、組織、器官的正常生理功能有非常重要的作用。膠原蛋 白具有非常復雜的特殊超螺旋結構，由Gly-X-Pro為基本重復體構成左手螺旋，X為其他氨 基酸殘基，缺乏色氨酸，膠原分子呈纖維狀，由三條肽鏈擰成，三條肽鏈均無鏈內氫鍵，僅受 鏈間氫鍵支撐。膠原蛋白具有無毒、止血、易吸收、非抗原、生物相容性和可生物降解等特 性，應用非常廣泛，尤其在美容和醫學領域，已成功應用于化妝品、矯形、保健、燒傷、創傷、 組織修復、創面止血等方面，故膠原蛋白的生產是近年來生物和化學領域研究的熱點。
[0003] 膠原蛋白傳統的生產方法是通過酸溶法、堿溶法、中性溶解法或者酶溶法從動物 來源(豬、牛、驢、魚等)的組織和器官，比如皮膚、軟骨、骨骼等提取和純化，但提取出來的膠 原蛋白水溶性差、純度低，并且存在著病毒反應和人體排異反應。為了解決這一難題，利用 生物技術手段進行對微生物進行基因重組的改造成為了主流，目前膠原蛋白已成功的在多 種宿主中得到了表達，主要有大腸桿菌、酵母菌等。但是由于細菌表達具有諸多弊端，比如 內毒素、熱源等安全問題，蛋白以包涵體的形式存在于細胞內，提取純化困難，而在畢赤酵 母中具有較高的分泌表達特性，目前在畢赤酵母表達過程中，誘導的模式是添加誘導劑甲 醇，而甲醇對菌體具有一定的毒害作用，其量應該要嚴格準確的控制，量少誘導強度不夠， 蛋白產量低，量多會對菌體產生毒害作用，使一部分菌體細胞自溶死亡，從而給后期提取純 化帶來很大的麻煩，故而蛋白表達量受到了誘導劑甲醇很大的限制。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種能夠克服甲醇對蛋白高效表達的限制，生產成本低，并 適用于工業化大規模生產的膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方法。
[0005] 本發明所使用的菌種為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168保藏編號： 〇6皿〇：如.7189保藏時間為2013.01.29分類命名：巴斯德畢赤酵母(？丨(^丨3?38如48) SMD1168保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0006] 畢赤酵母是甲醇營養型酵母，可利用甲醇作為其唯一碳源，醇氧化酶利用氧分子 將甲醇氧化為甲醛和過氧化氫，為避免過氧化氫的毒性，甲醛代謝主要在一個特殊的細胞 器一過氧化物酶體里進行，使得有毒的副產物遠離細胞其他組分，由于醇氧化酶與氧分子 的結合率低，因而畢赤酵母代償性的產生大量的酶，而調控產生醇過氧化物酶的啟動子也 正是驅動外源基因在畢赤酵母中表達的啟動子。畢赤酵母經過快速生長階段之后，菌體已 經得到了大量的積累，滿足了進行誘導表達的生物量條件，由于甘油是作為生長階段的碳 源，而誘導表達階段所采用的唯一碳源和能源是甲醇，同時也是使菌體表達蛋白的誘導劑， 所以涉及到碳源的代謝轉換，故本發明采用分階段誘導，使畢赤酵母更好的適應誘導劑甲 醇。
[0007]本發明的目的是提供一種能夠克服甲醇對蛋白高效表達的限制，生產成本低，并 適用于工業化大規模生產的膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方法。
[0008]本發明膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方法，包括以下步驟：
[0009] (1)菌種的純化與保藏、活化與擴培；
[00?0] (2)搖瓶、種子罐的種子培養；
[0011] (3)發酵罐內菌體培養與甲醇馴化、初始誘導階段與混合加大誘導階段；
[0012]甲醇馴化過程為：
[0013]第一階段加入甲醇，使發酵罐溶氧下降至16 %-20 %，維持時間3_4h，之后溶氧回 升;第二階段加入甲醇，使發酵罐內溶氧下降至15%_20%，維持時間2-3h;
[0014]初始誘導階段過程為：
[0015]調節發酵罐內的溫度為28°c，采用間歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18%-22%， 設置攪拌轉速為650rpm，流量為1L/(L·min)，罐壓為0.05MPa并保持不變，待生物量達到 240-260g/L時此階段結束；
[0016] 混合加大誘導階段為：
[0017] 調整發酵罐內溫度為25°C，將通氣流量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐 壓升高至〇.〇7MPa_0.09MPa，加大甲醇的流加速率以維持18%-22%的溶氧，一直維持到發 酵結束，菌體濕重維持恒定或下降幅度超過20g/L，此階段結束；
[0018] (4)將步驟(3)所得的發酵液后處理后，得到膠原蛋白。
[0019]所述甲醇馴化過程中第一階段發酵罐內控制甲醇的濃度為0.3%，第二階段發酵 罐內控制甲醇的濃度為〇. 5 %。
[0020] 所述種子罐的種子培養基和發酵罐內菌體培養基為改良后的FBS培養基，其配方 為：
[0022]所述初始誘導階段采用間歇式恒速流加甲醇，流加速率是3.55-3.95ml/h/L。
[0023] 所述混合加大誘導階段甲醇的流加速率為9.0-9.30ml/h/L。
[0024] 所述后處理包括離心去菌體、緩沖液抽提、鹽析、離子交換、柱層析精制和冷凍干 燥，細胞經離心后獲得上清液，然后加入甲酸緩沖液進行抽提，鹽析粗提，用離子交換樹脂 吸附以〇. 5mol/LNaCl、20mMTrispH8.0洗脫后，再用金屬螯合柱吸附、洗脫，收集蛋白冷凍 干燥，即可獲得膠原蛋白樣品。
[0025]與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
[0026] (1)本發明采用巴斯德畢赤酵母基因工程菌表達人膠原蛋白，生長繁殖快，醇氧化 酶基因的啟動子具有強誘導性和啟動性，與動物來源的產品相比無病毒隱患，與原核生物 表達體系相比，其表達載體不是以游離質粒形式存在，而是整合到染色體上，菌株十分穩 定，同時畢赤酵母為分泌表達，易于后期純化，培養基大部分為無機鹽，價格低廉，適合大規 模發酵生產；
[0027] (2)本發明與用單一階段添加誘導劑進行誘導相比，菌體對碳源甲醇有更好的適 應過程，在此基礎上，進入初始誘導階段，兼顧生長與表達，生物量得到了進一步的積累，最 終進入蛋白的大量表達階段，即混合加大誘導階段，循序漸進，逐漸加大誘導強度，在菌體 很好的適應誘導劑的同時，目標蛋白的產量也得到了大量的提高;菌體未出現自溶，發酵液 未大量出現泡沫;與單一用溫度誘導的方式相比，保證了目標膠原蛋白的正確折疊，同時提 高動力條件滿足了菌體在誘導表達階段對溶氧的大量需求，加大了誘導的強度，提高了目 標膠原蛋白的表達產量，同時又不會造成菌體中毒現象的發生，最終使發酵單位提高了 18%-20%，誘導劑利用率提高了 7%-15%。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明不同誘導方式的結果比較圖，坐標軸X上1，2,3分別代表單純用誘導 劑誘導、誘導劑加低溫誘導，混合加大誘導；
[0029]圖2為不同誘導方式甲醇利用率的比較圖，坐標軸X上1，2,3分別代表單純用誘導 劑誘導、誘導劑加低溫誘導，混合加大誘導。
【具體實施方式】
[0030] 以下結合實施例對本發明做進一步詳細的描述。
[0031] 實施例1
[0032]本發明膠原蛋白的分階段混合誘導發酵方法，包括以下步驟：
[0033] (1)菌種的純化與保藏、活化與擴培；
[0034] (2)搖瓶、種子罐的種子培養；
[0035] (3)發酵罐內菌體培養與甲醇馴化、初始誘導階段與混合加大誘導階段；
[0036] 發酵罐內菌體培養：
[0037]配FBS培養基，校正pH電極，校正溶氧電極，滅菌，降溫到30°C，注意水分蒸發損失。 插入補料瓶:氨水瓶、消泡劑瓶。補料50 %的甘油、甲醇;校正蠕動栗，精確計量進樣體積;設 置轉速300rpm，空氣通氣量1.0L/(L·min)，溫度為30°C，pH為5.0，溫度自動控制；與氨水栗 級聯控制，并開始校正培養基pH;接種前，每升培養基加入4.35ml無菌PTM1 (微量元素鹽）； 按照8%的接種量，將菌種從種子罐移入發酵罐，接入前需做鏡檢。隨著菌體對甘油的消耗， 待溶氧下降至18%_22%，提高攪拌轉速為300rpm，使溶氧控制在20%-40%，待甘油耗盡， 溶氧回升到100%以后，流加甘油速度11.8ml/h/L，維持溶氧在18%-22%，此時生物量逐漸 積累，待生物量積累到細胞濕重應達到200g/L時，停止流加甘油，保持40min，然后進入甲醇 馴化過程。
[0038]甲醇馴化階段：
[0039]第一階段在發酵罐中加入甲醇，使發酵罐內甲醇濃度為0.3%，隨后溶氧會急劇下 降，當下降至16%-20%，溶氧又會產生回升，回升至40%-45%，然后維持9min恒定，之后溶 氧又繼續下降，下降幅度為8%-12%，然后溶氧急劇的上升，此時說明第一次加入的甲醇已 完全消耗殆盡，此階段時長為3-4h;
[0040] 第二階段加入甲醇使發酵罐內甲醇濃度達到0.5%，溶氧立即下降至15%-20%， 維持2h，然后溶氧立馬回升，說明此階段加入的甲醇已完全消耗殆盡，可進入初始誘導階 段。
[0041] 初始誘導階段：
[0042]此階段首先調節發