一種生產反式-4-羥基-l-脯氨酸的發酵工藝的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的發酵工藝，屬生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]反式-4-羥基-L-脯氨酸(簡稱L-羥基脯氨酸或羥脯氨酸)主要存在于動物的膠原蛋白中，在膠原蛋白中含量可達10%左右，其作用是加強結締組織的彈性和韌性。羥脯氨酸目前廣泛應用于食品添加劑、化妝品和藥物中間體。
[0003]食品添加劑方面主要作為營養強化劑和增味劑，應用于果汁、清涼飲料、營養飲料等。由于羥脯氨酸具有呈苦味中的獨特甜味，能改善果汁飲料風味，而且還具有皮膚修復功能，常作為飲料添加劑。
[0004]在化妝品添加劑領域，由于其具有抗氧化、抗輻射的作用，是化妝品的重要添加劑。羥脯氨酸具有消除氧化劑和調整細胞的氧化還原狀態的潛在效果，因此許多化妝品中都添加有羥脯氨酸，以期保養皮膚和延緩衰老。
[0005]在醫藥領域，羥脯氨酸具有多種生理功能與獨特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥物，如結締組織受損、風濕性關節炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾病。羥脯氨酸存在兩個手性中心，易于衍生化，藥理活性多樣，被用于合成新一代培南類抗生素，還被應用于多種新創新制藥物的合成。
[0006]目前羥脯氨酸的生產主要有三種路線:動物骨膠提取法、生物催化法和發酵法。其中動物骨膠提取法是以動物骨膠為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程獲得產品，是目前國內生產企業采用的主要方法。但該方法由于需要用到強酸強堿水解，并且骨膠中成分復雜，分離提取難度大，需要用到離子交換樹脂，產生大量的廢水，在環保壓力日益增大的今天，漸漸面臨被淘汰的命運。
[0007]生物催化法是以L-脯氨酸和α -酮戊二酸為原料，利用高表達L-脯氨酸羥化酶的大腸桿菌作為酶源，經酶催化得到反式-4-羥基-L-脯氨酸。如中國發明專利申請CN1106457Α中，1995年協和發酵工業株式會社采用胞囊菌的羥基化酶，在添加維生素C，酮戊二酸，硫酸亞鐵的條件下，催化L-脯氨酸為反式-4-羥基-L-脯氨酸。中國發明專利申請CN 1150821Α中，利用胞囊菌羥基化酶基因構建表達質粒，導入大腸桿菌，構建工程菌。在發酵表達酶的同時流加葡萄糖和L-脯氨酸，發酵72h，累積產物24g/L。中國發明專利申請CN 103509813A中，構建羥基化酶質粒，導入大腸桿菌；在搖瓶發酵過程中加入L-脯氨酸，24h后產生0.3g/L羥基脯氨酸。中國發明專利申請CN 104278047A中，向羥基化酶大腸桿菌工程菌中導入透明顫菌血紅蛋白基因，在搖瓶發酵過程中加入L-脯氨酸，48h后產生4.9g/L羥基脯氨酸。中國發明專利申請CN 103911355 A，CN 201310064339.9和CN201310235337.6中，利用截斷優化的羥基化基因構建了工程菌，發酵表達酶，再利用菌體轉化，轉化時添加酮戊二酸、MES緩沖液、L-脯氨酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸等，使轉化率達97%以上，經72h反應，產物達26g/L。
[0008]上述生物催化法需要額外添加底物L-脯氨酸，有的還要添加α -酮戊二酸，這兩種原料的成本較高，且存在轉化率低，最終體系中殘留L-脯氨酸而難于純化的問題，使其生產成本居高不下。
[0009]發酵法相對于生物催化法和骨膠提取法，整體工藝相對簡單易操作，使用廉價的葡萄糖為原料，成本低。中國發明專利申請CN 1178245A中，1997年協和發酵工業株式會社強化宿主菌大腸桿菌L-脯氨酸生物合成系統，并敲除了脯氨酸分解酶系，利用胞囊菌羥基化酶基因構建表達質粒，導入改造的大腸桿菌，構建工程菌；在發酵時流加葡萄糖，生產羥基脯氨酸。該工藝生產簡單，成本優勢明顯，成為日本協和發酵工業株式會社多年來生產羥基脯氨酸的工藝。但該工藝在實際生產中也存在一些問題，一是表達基因通過質粒表達載體引入，在大規模長周期工業發酵中，質粒容易丟失，導致生產菌種遺傳穩定性差，發酵后期產量下降的問題；二是由于通過強化表達了能耐受反饋抑制表達的谷氨酸激酶突變體編碼基因proB74，這雖然增加了細胞內L-脯氨酸的代謝通量，但也導致L-脯氨酸過量積累，發酵終產物中除了羥脯氨酸外，還含有較多的L-脯氨酸，二者性質比較相近，只能通過離子交換樹脂加以分離純化，從而產生了大量的酸堿廢水，大大增加了成本。
[0010]目前發酵法生產反式-4-羥基-L-脯氨酸還存在轉化率低，發酵時間長的問題。中國發明專利申請CN 1150821A報道，發酵72h，產量24g/L。中國發明專利申請CN103509813A報道江南大學構建羥基化酶質粒，導入大腸桿菌，在搖瓶發酵過程中加入L-脯氨酸，24h后產生0.3g/L羥基脯氨酸。中國發明專利申請CN 104278047A報道江南大學向羥基化酶大腸桿菌工程菌中導入透明顫菌血紅蛋白基因，在搖瓶發酵過程中加入L-脯氨酸，48h后產生4.9g/L羥基脯氨酸。
【發明內容】
[0011]本發明要解決的技術問題是開發縮短發酵時間，提高產量，提高糖轉化率的發酵技術。
[0012]本發明解決上述問題的技術方案如下:
一種生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的發酵工藝，采用pH為1-6的除菌亞鐵離子溶液，在發酵過程中以流加方式加入發酵罐，保持發酵罐內穩定的亞鐵離子濃度；所述發酵以葡萄糖為碳源。
[0013]作為上述技術方案的優選，采用pH為1-6的除菌亞鐵離子溶液，在發酵過程中以流加方式加入發酵罐，保持發酵罐內穩定的亞鐵離子濃度；所述發酵以葡萄糖為碳源。
[0014]作為上述技術方案的優選，亞鐵離子在發酵體系中的總摩爾濃度為
0.35-3.5mmol/L，在規定時間內勾速流加。
[0015]本發明所述的亞鐵離子總濃度是一個設計值，由于亞鐵離子并非一次性加入到發酵罐中，而是流加。需要流加的原因是亞鐵離子易氧化，而產生消耗。總濃度是假設亞鐵離子一次性加入到發酵罐中時的濃度值。因為流加的關系，發酵罐中的實際亞鐵濃度值不會達到總濃度值。
[0016]作為上述技術方案的優選，所述的規定時間為在48小時內。
[0017]作為上述技術方案的優選，所述亞鐵離子溶液采用膜過濾除菌或者高溫滅菌。
[0018]作為上述技術方案的優選，所述亞鐵離子溶液中還加有抗氧化劑或還原劑。
[0019]作為上述技術方案的優選，發酵過程中，所述抗氧化劑或還原劑的濃度為0.35-3.5mmol/L。
[0020]作為上述技術方案的優選，所述抗氧劑或還原劑為抗壞血酸。
[0021]作為上述技術方案的優選，所述亞鐵鹽為七水硫酸亞鐵。
[0022]作為上述技術方案的優選，所述發酵采用的菌種為保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2015年9月17日，保藏編號為CCTCC Μ 2015550的大腸桿菌HJ(Escherichia coli HJ)。
[0023]作為上述技術方案的優選，活化培養工程菌大腸桿菌HJ(EsCheriChia coli HJ),并將培養好的種子逐級放大，并在發酵罐中進行好氣培養，培養溫度33-37°C，控制pH為
6.5-7.0，溶氧20%以上，發酵時間40-60小時；配置無菌亞鐵離子溶液，并在發酵過程中流加亞鐵離子溶液；在發酵后期取樣檢測羥脯氨酸含量，至含量不再增加為止。
[0024]本發明選擇將亞鐵離子采取保護促