Hbb基因突變和hla分型檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因組突變檢測領域，特別涉及HBB基因突變和白細胞抗原系統分型 的檢測。
【背景技術】
[0002] β-地中海貧血是在全世界范圍最常見的單基因疾病，它是由于β珠蛋白基因 突變導致β鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的溶血性疾病。根據β珠蛋白基因表 達的受抑制程度，β-地中海貧血分為兩種類型：β珠蛋白鏈完全不能合成者稱為β〇地 中海貧血，β-珠蛋白鏈尚能合成但合成量減少者稱為β+地中海貧血。β-地中海貧血 以小細胞低色素性溶血型貧血肝脾腫大（脾大明顯）、骨髓擴增發育遲緩合并感染、骨骼改 變等為主要臨床癥狀。β-地中海貧血在南方地區最為高發，廣東、廣西β-地中海貧血 攜帶率分別為 2. 54%和 6. 78%(ChenW,ZhangX，ShangX，etal.Themolecularbasis ofbeta-thalassemiaintermediainsouthernChina:genotypicheterogeneityand phenotypicdiversity.BMCMedGenet. 2010Feb25 ;11:31)。迄今為止，世界范圍已發現 800 多種β地中海貧血的基因突變類型（http://globin.cse.psu.edu/cgi_bin/hbvar/ query_vars3)〇
[0003] 目前國內外對β-地中海貧血的治療分為產前診斷、規范性長期輸血和去鐵治 療、HLA相合的造血干細胞移植和脾切除術等（劉越，米佳，黃耀江.人類白細胞抗原基 因研究進展[J].生物學教學.2007(11))。輸血治療存在鐵負荷導致的并發癥，骨髓移植 則一直無法擺脫免疫排斥和移植抗宿主病的并發癥，而造血干細胞具有重建個體造血系 統的全能性和自我更新的能力，理論上將正常的β-珠蛋白基因導入造血干細胞并輸回 體內，使之獲得適宜表達，患者將獲得終生治療。隨著臨床的需要、分子細胞生物學及分 子生物學技術的快速發展，PGD已經從避免基因病遺傳擴展到以移植造血干細胞為目的對 植入前胚胎進行人類白細胞抗原（humanleucocyteantigen，HLA)分型的非疾病性檢測 (VerlinskyY,RechitskyS,SharapovaT,etal.PreimplantationHLAtesting.JAMA 2004May;291 (17) : 2079-85)。在器官移植和造血干細胞移植中，當同種異基因骨髓移植時， HLA不同時可引起免疫排斥反應。由于HLA具有高度多態性，供受者HLA的差異決定了同 種異體器官移植后幾乎不可避免地發生免疫排斥反應。配型匹配點越多，移植術后的效果 就越理想，受者存活時間就越長。如果匹配的點少，移植后發生急、慢性宿主抗移植物反應 (hostversusgraftreaction，HVGR)和移植物抗宿主病（GVHD)的機率明顯增加，存活時 間短，因此在器官移植、造血于細胞移植中HLA配型的意義重大。正是因為尋找HLA基因型 一致的供者極其困難，近年國外有報道β-地中海貧血這種嚴重致殘、致死而又無法根治 的疾病在有需要進行造血干細胞移植患兒的家庭中，對植入前胚胎進行HLA配型聯合或不 聯合基因遺傳病的PGD檢測，選擇與患兒HLA基因型一致且正常的純合子（不攜帶致病基 因）或者雜合子（攜帶隱性致病基因）胚胎移植，創造一個救助者同胞（SaviourChild， SC)，分娩時使用SC的臍血或者骨髓用于治療現存患兒，為治療此類患者提供一種新的、效 果可能更理想的途徑（Tur-KaspaI，JeelaniR.ClinicalguidelinesforIVFwithPGD forHLAmatching.ReprodBiomed0nline2015Feb;30(2) :115_9)〇
[0004] β珠蛋白基因簇位于11號染色體短臂上，覆蓋50kb，其結構如圖1。從5' 一 3' 分別為胚胎ε球蛋白基因、胎兒Gy和Αγ球蛋白基因、假基因Φβ、δ和β球蛋白基因。 每一編碼球蛋白的基因均包含3個外顯子、2個內含子。在ε球蛋白基因上游20kb處，有 β球蛋白基因的定位控制序列（l〇cus-control_region，LCR)，它包括5個紅細胞系特異的 核酸酶高酶位點，調控著其下游基因的表達（OlivieriNF,Thebeta-thalassemias.NEngl JMed. 1999Jul8 ;341 (2):99-109)。
[0005]β珠蛋白肽鏈含146個氨基酸，由β珠蛋白基因所編碼。β珠蛋白基因全長 1605bp，含3個外顯子和2個內含子。β-地中海貧血的分子基礎是β珠蛋白基因的點 突變或核苷酸序列缺失，造成β珠蛋白鏈合成的減少或缺失。中國人群中已發現的大部 分突變集中在基因的3'端調控區、外顯子1、內含子1和外顯子2中，以⑶41-42 (-CTTT)、 IVS-II-654 (C>T)、CD17 (Α>Τ)、TATA盒nt-28 (A>G)、CD71-72 (+Α)和nt-29 (A>G)這 6 種突 變類型較為常見，約占中國人β-地中海貧血基因突變總數的93.3% (杜傳書.地中海貧 血研究的現狀與未來[J].中華醫學遺傳學雜志，1996, 13(5) :257)。
[0006]β-地中海貧血的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，即兩條染色體上的HBB基因均 存在缺陷時才會導致β-地中海貧血。一條染色體上的ΗΒΒ基因正常，而另一條染色體上 的ΗΒΒ基因存在缺陷不會致病，此時稱之為β-地中海貧血攜帶者。若男女雙方均為β-地 中海貧血攜帶者，生育β-地中海貧血患兒的風險為25% (圖2)。
[0007] 人類白細胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA)系統是一群與人體免疫應答反 應密切相關的基因簇，位于第6號染色體短臂6p21. 31區，長約3600kb，占人類基因組的 1/3000,現已完成其全序列的測定（Completesequenceandgenemapofahumanmajor histocompatibilitycomplex.TheMHCsequencingconsortium.Nature. 19990ct28; 401 (6756) :921-3)。它是人類基因組中至今為止最復雜、最具多態性的遺傳體系，其等位基 因的多態性影響著免疫應答和抗原肽的遞呈等。
[0008]HLA的基因結構HLA復合體目前分為HLA-I、HLA-II和HLA-III三類基因（見圖 3)。HLA-I類基因區靠近染色體頂端，長約1500kb，區內基因被命名為經典的HLA-A、B、 C和非經典的HLA-E、F、G等基因。HLA-II類基因最靠近染色體著絲點，長約1000kb，被命 名為HLA-D。HLA-D又劃分為HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP等亞區，此外還有DMA、DMB、LMP2、 11^734?1以及14?2等基因位點。！11^-111類基因區位于11類基因與1類基因區之間，長約 1000kb，已檢出40多個基因，包括編碼補體蛋白C2、因子B、C4A和C4B等基因（BodmerJ G,MarshSG,AlbertEDetal. 1995.NomenclatureforfactorsoftheHLAsystem. TissueAntigens, 46(l):l_18)〇
[0009] β-地中海貧血基因檢測方法有：限制性片段長度多態性連鎖分析、探針斑點雜 交技術、反向點雜交方法、缺口PCR(Gap-PCR)、擴增不應突變系統、單鏈構向多態性、DNA芯 片技術、DNA序列測定法、實時熒光定量、多重連接依賴性探針擴增（MLPA)、高效液相色譜 技術（HPLC)。當父母雙方攜帶有明確的HBB基因致病位點，可以通過產前干預措施阻止 致病位點向下一代傳遞。HLA基因分型方法有：PCR-SS0P(序列特異性寡核苷酸探針）、 PCR-RFLP(限制性片段長度多態性）、PCR-SSP(序列特異性引物）、PCR-SNP(單核苷酸多態 性）、SBT(直接測序分型）和基因芯片。但目前這些基因檢測方法靈敏度低，只適合于采用 新生兒外周血作為檢測對象，不適合針對單細胞的移植前篩查。因此急需開發一種檢測試 管嬰兒技術中胚胎HBB基因突變檢測和HLA基因分型方法的新方法。
[0010] 采用試管嬰兒技術能有效幫助有需要進行造血干細胞移植的β-地中海貧血患 兒家庭。選擇與患兒HLA基因型一致且正常的純合子（不攜帶致病基因）或者雜合子（攜 帶隱性致病基因）胚胎移植，創造一個救助者同胞（SaviourChild，SC)，分娩時使用SC的 臍血或者骨髓用于治療現存患兒，為治療此類患者提供一種新的、效果可能更理想的途徑。
[0011] 試管嬰兒技術是將卵子與精子取出后置于特定的培養液內培養、受精，受精卵在 恒溫孵箱中發育為胚胎后移植回母體子宮，最終發育成胎兒。挑選健康胚胎移植并且與患 兒HLA基因型一致是成功治療造血干細胞移植的β-地中海貧血患兒的關鍵因素。
【發明內容】
[0012] 本發明設計了一種基于高通量測序技術檢測ΗΒΒ基因突變和HLA分型的方法。
[0013] 本發明的第一方面提供了一種檢測ΗΒΒ基因突變的引物組合物，其包括特異性擴 增人類胚胎β-地中海貧血ΗΒΒ基因上下游1Mb范圍內緊密連鎖的多態性位點（SNP)的引 物。
[0014] 優選地，所述特異性擴增人類胚胎β-地中海貧血HBB基因上下游1Mb范圍內 緊密連鎖的多態性位點（SNP)的引物的上下游序列分別選自SEQIDN0:2n-1和SEQID NO: 2n，其中η為1~69的自然數。
[0015] 在一個特定的實施方案中，所述檢測ΗΒΒ基因突變的引物組合物包括SEQID NO: 1-138的全部引物序列。