抑癌基因ATOH8及其編碼蛋白在制備iPSC中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種新的抑癌基因及其編碼蛋白的應用，特別涉 及抑癌基因AT0H8及其編碼蛋白的應用。
【背景技術】
[0002] 肝細胞癌是世界第五大癌癥，它每年影響上百萬人的生活。外科手術的方法對肝 癌患者的長期存活帶來希望，但是只適用于少部分適應癥患者。肝癌通常在晚期被診斷，并 已經發生了轉移和擴散。對于大多數肝癌患者，存活率只有大約6個月左右。對于非手術 適應癥的患者，化療是主要的治療方法。而肝癌病人的化療平均生存率只有4個月。因此， 開發更加可靠的生物標記物診斷方法，更加有效的治療和預后恢復的靶點藥物是被迫切需 要的。
[0003] 科學家已經提供了很多確鑿的證據證實了腫瘤干細胞的存在及其重要性，腫瘤干 細胞與正常干細胞有很多相似之處，具有眾多相同的表面標記物，且都具有自我更新和分 化的能力。另外，腫瘤干細胞具有很強的致瘤性。對腫瘤干細胞特性的進一步了解將有助 于開發更加有效的癌癥診斷/治療手段，故腫瘤醫生和科學家們致力于研究肝癌腫瘤干細 胞的機理和解決其抗藥性。最近，香港大學關新元教授的團隊在世界上首度發現了以CD133 作為標記物的肝癌干細胞。類似的報道也先后被其他科學家發現并報道，如CD90和CD24 也被作為肝癌干細胞的表面標記物而被發現。即便如此，迄今對于腫瘤干細胞表面標記物 的研究還知之甚少。
[0004] 重編程已分化的體細胞成為多能干細胞在再生醫學領域的研究中具有重要的意 義。2007年誘導多能干細胞（iPSC)的發現是人類疾病（包括肝臟的遺傳性疾病和肝癌） 的研究過程中的革命性進展。iPSCs向肝細胞定向分化的方法也為腫瘤疾病提供了新的研 究平臺和藥物篩選平臺。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種新的抑癌基因AT0H8(atonalhomolog8,無調性同源 物質8)及其編碼蛋白的應用。本發明研究了AT0H8在腫瘤組織特別是肝癌中的表達特點 及其調控機制、研究AT0H8的新功能并提供AT0H8的新應用。
[0006]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在誘導癌癥非腫瘤干細胞重編程成為腫瘤干細胞 中的應用。
[0007] 優選的，所述癌癥為肝癌。
[0008]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備誘導多能干細胞中的應用。
[0009] 本發明的有益效果是： 發明人在肝癌腫瘤細胞中發現了一種新的抑癌基因AT0H8,在242例病人組織樣本中 發現，AT0H8在肝癌病人中超過48%低表達，并且與原發性肝癌病人的生存率低和復發率 高等問題顯著相關。體內和體外的功能性研究分析表明，AT0H8能夠抑制肝癌細胞的生長、 迀移和轉移。更令人興奮的是，AT0H8能夠促進肝癌細胞凋亡并增加肝癌細胞對化療藥物 的敏感性。并且，AT0H8可抑制干細胞多能性基因和干細胞相關生物標記物的表達，這些多 能性基因在人的胚胎干細胞保持其多能性的過程中具有重要的意義，并能夠誘導體細胞重 編程成為誘導多能干細胞，進一步的研究證實，AT0H8在誘導多能干細胞中低表達。綜上 所述，本研究發現AT0H8是干細胞相關基因的重要抑制物，在癌癥的發生、發展過程中具有 重要作用，AT0H8能夠促進干細胞分化和降低癌癥干細胞對化療藥物的耐藥性，并且，沉默 AT0H8的表達為誘導iPSCs形成提供了新的有效途徑，本發明為腫瘤疾病提供了新的診斷、 治療方法和藥物篩選平臺。
【附圖說明】
[0010] 圖1顯示RNA-seq高通量測序分析AT0H8在肝癌病人癌旁組織及癌組織中的表達 情況。
[0011] 圖2顯示AT0H8在242例肝癌病人癌旁組織及癌組織中的表達情況。
[0012] 圖3顯示AT0H8低表達與肝癌病人生存率低的相關性。
[0013] 圖4顯示AT0H8對干細胞相關基因表達的影響。
[0014] 圖5顯示雙熒光素酶報告基因檢測法檢測AT0H8對干細胞相關基因的抑制作用。
[0015] 圖6顯示電泳迀移率實驗結果。
[0016] 圖7顯示AT0H8過表達對腫瘤細胞的生長、克隆形成、集落形成、轉移能力的影響。
[0017] 圖8顯示AT0H8過表達對肝癌細胞的侵襲能力、體內成瘤能力的影響。
[0018] 圖9顯不沉默AT0H8將肝癌的普通腫瘤細胞重編程成為肝癌腫瘤干細胞。
[0019] 圖10顯示沉默AT0H8可促進體細胞重編程成為誘導多能干細胞。
[0020] 圖11顯示AT0H8提高肝癌細胞對于化療藥物的敏感性。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例，進一步闡述本
【發明內容】
。下列實施例中未注明具體條件的 實驗方法，通常按照常規條件，如，《分子克隆實驗指南》（第三版）中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。
[0022] 實施例1AT0H8在肝癌組織中表達下調 1.RNA-seq高通量測序 通過提取3對肝癌病人的癌組織及其對應的癌旁組織的RNA進行高通量測序，發現AT0H8在3對病人的癌組織中全部低表達。結果如圖1所示：448N(41)表示448樣本癌旁 組織在樣本中被測到讀數是41 ;448T(1)表示448樣本癌組織在樣本中被測到讀數是1; 473Ν(29)表示473樣本癌旁組織在樣本中被測到讀數是29 ;473Τ(3)表示473樣本癌組 織在樣本中被測到讀數是3 ;510Ν(39)表示510樣本癌旁組織在樣本中被測到讀數是39; 510Τ(3)表示510樣本癌組織在樣本中被測到讀數是3。
[0023] 2.qRT-PCR檢測ΑΤ0Η8在肝癌病人的臨床標本中的表達 設計qRT-PCR引物（引物序列為表2中的SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6)。根據qRT-PCR的結果，定義AT0H8在癌旁組織中的表達超過其在癌組織中的表達4倍為AT0H8低表達。結 果顯示在242例肝癌病人的癌組織中超過48%低表達（見圖2)。
[0024] 3.AT0H8低表達具有臨床意義 通過SPSS進行統計分析發現，肝癌病人的臨床資料和AT0H8在臨床樣本中的表達，與 肝癌病人的生存率低、體內AFP表達過高以及肝癌的低分化相關（見圖3和表1)。
[0025] 表1臨床資料與AT0H8表達情況的相關情況
a部分數據無法使用，以現有數據進行統計；bAT0H8在癌旁組織中的表達超過其在癌 組織中的表達4倍定義為AT0H8低表達；*顯著性差異（P〈0. 05)。
[0026] 實施例2AT0H8對干細胞多能性基因的抑制作用 1、構建穩定的AT0H8過表達的細胞株 肝癌細胞株Huh7(日本北海道大學）和PLC8024 (中國科學院武漢病毒研究所）由DMEM培養基（DMEM;GibcoBRL)輔以10%的胎牛血清（GibcoBRL)在37°C的二氧化碳培養箱進 行培養。
[0027] ①構建AT0H8的表達質粒 用PCR擴增AT0H8的cDNA全長序列，引物序列如下： F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQIDNO. 1)； R:ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT(SEQIDNO. 2)〇
[0028] 將純化的AT0H8全長序列構建到pLcmliiVVS-TOPO?表達載體上（Invitrogen， K4950-00)，獲得AT0H8 表達質粒pLenti6-AT0H8。
[0029] ②轉染肝癌細胞 分別利用Lipofectamine2000(Invitrogen，11668)和優化的包裝質粒(Invitrogen,K4975-00)將獲得的pLenti6_ATOH8和作為對照的pLenti6空載體 (pLenti6-vector)轉入293FT細胞。并于12小時后更換DMEM培養基（DMEM;GibcoBRL) 輔以10%的胎牛血清（6讓〇〇8此）。48小時及72小時后收集慢病毒上清，并轉導進入此117 和PLC8024細胞系。
[0030] 用殺稻痕菌素（6ug/mL;Sigma-aldrich)篩選2周左右可得到穩定的AT0H8過表 達的細胞株8024-AT0H8和Huh7-AT0H8,對照細胞株分別為8024-Vec和Huh7-Vec。
[0031] 2、構建穩定的AT0H8沉默的細胞株 肝癌細胞株QSG7701 (中國科學院武漢病毒研究所）由DMEM培養基（DMEM;GibcoBRL) 輔以10%的胎牛血清（FBS)(GibcoBRL)在37°C的二氧化碳培養箱進行培養。
[0032]帶有特異性穩定表達的AT0H8-shRNA(sh4,TGTGCTCAACCATCTGCTT(SEQID N0.3);sh7，GGTGCCGTGCTACTCATAT(SEQIDN0.4))和陰性對照（psiHIV-Ctl)由 GeneCopoeia公司提供，利用Lipofectamine2000(Invitrogen, 11668)和優化的包裝質粒 (GeneCopoeia,HPK-LvTR)將AT0H8-shRNA和作為對照的psiHIV-Ctl轉入 293FT細胞。并于 12小時后更換培養基01^]?培養基（01^]\1斯1^〇81^)輔以10%的胎牛血清（6讓(3〇81^)。 48小時及72小時后收集慢病毒上清，并轉導進入QSG7701細胞系。
[0033] 轉染48小時后用3μg/mL的嘌呤霉素（OriGene)篩選2周左右得到穩定的AT0H8 沉默的細胞株7701-sh4、7701-sh7,和對照細胞株7701-Ctl。
[0034] 3、檢測干細胞相關基因的表達情況 用TRIzol試劑盒（invitrogen)提取AT0H8過表達和沉默的肝癌細胞及其對照細胞的 總RNA。按試劑盒操作說明，取2ygRNA用逆轉錄PCR試劑盒（Clontech)合成cDNA。cDNA 經PCR擴增后其產物用美國ABI公司的ABIPRISM7900HT熒光定量PCR儀對AT0H8基因 轉錄水平進行實時檢測及定量。
[0035] 結果顯示AT0H8的過表達會抑制干細胞相關基因的表達，如Sox2、Nanog、0ct4、 AFP、⑶133和⑶24(圖4A)。而沉默AT0H8的表達將促進這些干細胞相關基因的表達（見 圖4B)。干細胞相關基因表達檢測的引物見表2。
[0036] 表2相關基因表達檢測的引物
。：
[0037] 4、利用雙熒光素酶報告基因檢測和電泳迀移率實驗（EMSA)的方法證明AT0H8是 否可以綁定在干細胞相關基因的啟動子區域的E-box和bHLHmotifs上。
[0038] ①雙熒光素酶報告基因檢測法 克隆約2kb的0ct4、Nanog和⑶133的啟動子序列到載體pGL3_enhancer vector(Promega,E1771)上，得到pGL3-〇tc4、pGL3-Nanog、pGL3_CD133。克隆引物序列見表 3。按10:10:1混合在熒光霉素載體上構建的0ct4、Nanog和S0X2的啟動子，pLenti6-AT0H8 和海腎熒光素酶（Promega，E2241)根據操作說明同時用Lipofectamine2000轉染進入 Huh7 細胞系。pGL3-ctl(pGL3_control)載體（Promega，E1741)作為實驗的陽性對照， pGL3-enhancer載體（Promega，E177