分化培養基及其在制備神經干細胞中的用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，具體的，本發明涉及培養基及其應用，更具體得，本發明涉及一種分化培養基、分化培養基在制備神經干細胞中的用途以及一種制備神經干細胞的方法。
【背景技術】
[0002]干細胞(stem cells)是人體及其各種組織細胞的初始來源，其最顯著的生物學特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細胞根據不同的來源分為成體干細胞(somatic stem cells)和胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)。成體干細胞包括骨髓間充質干細胞、胰腺干細胞、神經干細胞等，在成體組織中存在的。
[0003]1981年，ES細胞的分離和培養首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、最成熟的干細胞體系。而人的胚胎干細胞則始于1998年，美國威斯康辛大學(Universityof Wisconsin)科學家湯姆森(James A.Thomson)帶領研究團隊首次從人類胚胎組織中提取培養出胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell, ES Cell)株，并且證實此株細胞具有全會泛干細胞特征[Thomson, J.A.，et al.Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science, 282 (1998): 1145-1147.]。這篇論文標志著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱作“干細胞研究之父”。
[0004]人胚胎干細胞(hES)細胞研究的應用前景主要是再生醫學領域，在組織工程學領域中以hES細胞作為種子細胞，可為臨床上細胞、組織或器官的移植治療提供大量的材料。通過控制hES細胞分化培養環境、轉染能夠促進ES細胞定向分化的關鍵分子基因等體外誘導分化策略，可獲得特異性的組織細胞類型。這類細胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。
[0005]然而，一直以來，hES細胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面:
(1)供體卵母細胞的來源困難，hES細胞建系效率低。此外，SCNT技術的不成熟必將需要進一步耗費更多的人類卵母細胞，故而其來源難以得到保證；(2)免疫排斥反應，除非采用SCNT技術，否則患者對hES細胞分化而來的各種細胞和組織仍然存在免疫排斥反應；(3)hES細胞具有成瘤性，移植到受體的體內后有發展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術、給移植細胞設置自殺基因等應對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題；(4)體外保持hES風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似的風險。
[0006]為避開hES細胞和治療性克隆研究的倫理學爭論，需要找到一種替代途徑，以便將人類的體細胞直接轉化為多潛能干細胞，為患者提供“個性化”的自體干細胞。2003年，Gurdon研究小組發現，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外周血淋巴細胞的細胞核注入爪蟾卵母細胞后，哺乳動物細胞核的分化標志物喪失，而哺乳動物干細胞中最具特征性的標志物0ct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從而表達0ct4[Byrne JA, et al.Nuclei of adult mammalian somatic cells are directlyreprogrammed to oct_4stem cell gene express1n by amphibian oocytes.Curr B1l2003 ；13:1206-1213.]ο
[0007]2006年，日本京都大學Yamanaka研究小組采用體外基因轉染技術，從24個因子中篩選出0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子，通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞，在小鼠ES細胞的培養條件下獲得了 Fbxl5+的多潛能干細胞系，該細胞系在細胞形態、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似，而在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞，故將其命名為誘導的多能性干細胞(iPS細胞)。
[0008]Yamanaka研究小組利用相同的技術，將上述同樣的4個轉錄因子導入到人皮膚成纖維細胞中，也成功獲得了 iPS細胞。原代人類成纖維細胞樣滑膜細胞和源自新生兒成纖維細胞的細胞系同樣也可被重構成為iPS細胞。這類iPS細胞在細胞形態、增殖能力、表面抗原標志、基因表達譜、多潛能干細胞特異性基因的表觀遺傳學狀態、端粒酶活性等方面與hES細胞相似，并且在體外培養時和在小鼠體內畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不同細胞類型[Takahashi K et al，Induct1n of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 2007 ； 131:861-872.] 0 與此同時，威斯康辛大學Thomson研究小組也報道了成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有hES細胞基本特征的人類iPS細胞，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選基因中選擇了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28 等 4 個基因進行轉導[Yu J et al，Induced pluripotent stem cell linesderived from human somatic cells.Science 2007，318:1917—1920]。這一被學界稱為生物科學“里程碑”的重大突破有望幫助科學家繞過克隆技術的倫理、道德紛爭，為醫學應用打開大門。
[0009]繼此之后，iPS在重編程的誘導方法、誘導效率、誘導細胞來源及生物安全性方面均陸續取得了重要突破。在iPS細胞再分化方面，也得到了一定的發展。目前，在iPS細胞的上皮細胞分化、肝細胞分化等方面，均已建立了較為穩定的分化體系[Ahmad Sm, et al.Differentiat1n of human embryonic stem cells into cornealepithelial-like celIs by in vitro replicat1n of the corneal epithelialstem cell niche.Stem Cells,2007, 25(5):1145-55.；Metallo CM, et al.Directeddifferentiat1n of human embryonic stem cells to epidermal progenitors.Methods Mol B1l, 2010，585:83-92.；Song ZH,et al.Efficient generat1n ofhepatocyte—1ike cells from human induced pluripotent stem cells.CellRes, 2009, 19 (11)，1233-1242.]。在神經干細胞細胞分化方面，iPS細胞與ES細胞也取得了一定的石開究成果[Kim DS, et al.Robust enhancement of neural differentiat1n fromhuman ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiat1npropensity.Stem Cell Rev, 2010, 6(2):270-281.]0
[0010]神經干細胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞。神經干細胞具有分化為神經神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，能自我更新，從而為神經組織提供大量的功能性細胞，在多種神經系統疾病方面具有著重要的應用價值和研究意義。但是，神經干細胞的來源十分有限:從神經組織中進行原代分離，在很大程度上受到組織來源的限制；由其他種類成體干細胞分化而來的神經前體細胞，在功能上又存在著一定的限制性，這主要是由于成體干細胞本身分化能力有限，難以完全再生功能性神經干細胞。所以，開發神經干細胞的來源一直是神經科學亟待解決的問題。
[0011]ES和iPS技術的建立，為神經干細胞的再生開發了新的研究方向，這兩種細胞自我更新能力較強，且具有高度的分化能力，目前，已有多個課題組建立了 ES和iPS細胞向神經干細胞分化的技術方法，例如:EB誘導法，PA6細胞共培養法等[Bain G, et al.Embryonicstem cells express neuronal properties in vitr0.Dev B1l.1995,168(2):342-357.；Okabe S, et al.Kang HC, et al.Behav1ral improvement after transplantat1n ofneural precursors derived from embryonic stem cells into the globally ischemicbrain of adol