一種富含造血干細胞的臨床用臍血單核細胞的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬細胞生物學領域，具體涉及一種富含造血干細胞的臨床用臍血單核細胞 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 干細胞(StemCelIs，SC)是一類具有自我復制能力（self-renewing)的多潛能細 胞，是原始且未特化的細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。干細胞存在所有多細胞組織里，能經由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細胞。干細胞的來源有很多，包括 胎盤、臍帶、臍帶血與骨髓等。
[0003] 嬰兒出生后遺留在胎盤和臍帶中的血是干細胞的重要來源。臍帶血中的造血干細 胞可以用來治療多種血液系統疾病和免疫系統疾病，包括血液系統惡性腫瘤(如:急性白血 病、慢性白血病、多發性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合癥和淋巴瘤等）、血紅蛋白病(如:海洋性 貧血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障礙性貧血）、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺陷疾 患、自身免疫性疾患、某些實體腫瘤(如：小細胞肺癌、神經母細胞瘤、卵巢癌和進行性肌營 養不良等）。自1988年臍血干細胞就用來治療根達綜合癥、亨達綜合癥、和拉綜合癥和急性 淋巴細胞性白血病等許多兒童疾病。截至2011年，臍帶血不僅已能有效地治療幾十種難治 性疾病和多種不治之癥，而且它所能治療的疾病種類還在不斷地增加。自體儲存的臍帶血 一旦需要使用時，不需配型，細胞活性強，無免疫排斥的危險，移植成活率高，治愈率高，醫 療費用低。
[0004] 在人臍血中有一類具有干細胞特征的細胞群體，被稱為人間充質干細胞(MSCs)。 人間充質干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導條件下可分化為三胚層細 胞，如骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和神經細胞等。此外，還表達IL6、G-CSF和SCF等 多種造血細胞生長所需要的因子，能夠維持長期培養的造血祖細胞增殖，顯示MSC具有支持 造血和促進造血恢復的作用。同時研究表明MSC具有免疫調節作用，在體外能夠抑制T淋巴 細胞增殖，體內動物實驗發現MSCs移植可以抑制異體免疫反應，減輕移植相關的排斥反應， 并延長異體移植物的存活時間。最近的臨床試驗發現MSCs聯合造血干細胞移植可以減輕 GVHD并降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調節能力決定了其在細胞治療、組織工 程等領域具有廣闊的應用前景。
[0005] 目前常規臍血單核細胞(富含造血干細胞)多用動物血清加白蛋白凍存，如雞、豬、 牛等，其中胎牛血清因獲取量大、污染輕而被廣泛應用。但近年隨著人畜共患病發病率的增 加，以異種血清培養的組織向臨床應用的安全性受到質疑，因此自體血清培養越來越受到 重視。
[0006] 中國發明專利【申請號】201510159307.0公開了一種臍血單個核細胞凍存液、應用、 制備方法。本發明提供的一種臍血單個核細胞凍存液，包括二甲基亞砜(DMS0)聯合勃脈力A (復方電解質注射液）、羥乙基淀粉(HES)，該方案相比傳統配方，可避免動物源性病原體的 污染，同時避免采用細胞培養基作為凍存液組成成分，并保證了良好的細胞凍存效果，凍存 2個月后，用本發明凍存液凍存的CBMC復蘇后細胞活率平均值為94.73%，顯著(P<0.05)高 于用傳統凍存液（10%DMS0+90%FBS)的凍存效果。細胞復蘇后可直接進行臨床移植，在細 胞治療臨床應用方面頗具實用價值。
[0007] 中國發明專利【申請號】02103676.4公開了臍血造血干細胞的制作方法，按如下步 序進行：（1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內；（2)加入紅細胞沉淀劑；（3) 離心分離1，將臍血采集袋中臍血中的紅細胞分離；（4)移出紅細胞，將紅細胞輸送到紅細胞 收集袋內；（5)離心分離2,將白細胞包括造血干細胞與血漿再一次分離；（6)移出血漿，將被 分離的血漿輸入到血漿收集袋內，臍血收集袋內剩余的臍血為含富集白細胞的臍血；（7)加 入冷凍劑，將臍血收集袋中的富集白細胞臍血中加入冷凍劑；（8)包裝；（9)降溫；（10)入庫 保存。用本發明方法制作的造血干細胞可長期存放，以便于隨時取用，大大地方便了治療， 及時解除病人痛苦，適用于制作在臍血庫中長期存放的造血干細胞。
[0008] 但目前公開的各類間充質干細胞制備方法雖均能獲得臍血單核細胞（富含造血干 細胞），但都不符合臨床應用的標準，本發明擬從原料采集開始直至細胞制備完成的全過程 進行臨床級、統一、系統監控，以實現臍血單核細胞(富含造血干細胞)的臨床標準產品。
【發明內容】
[0009] 針對現有技術缺陷，本發明提供一種富含造血干細胞的臨床用臍血單核細胞的制 備方法，本發明制備方法在臍帶采集前對產婦進行篩選，以符合條件的健康足月產婦志愿 者作為采集目標，之后進行分離直接進行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的的中間品進 行一系列質量檢測，冷凍后細胞復蘇洗滌待用，活率無明顯降低。
[0010] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0011] 本發明提供了一種富含造血干細胞的臨床用臍血單核細胞的制備方法，包括如下 步驟：
[0012] 步驟A，取適量分娩獲得的臍帶血，置于臍血保存袋中冷藏保存；
[0013]步驟B，臍血分離:將臍血通過兩步離心法去掉絕大多數紅細胞，分離出我們要的 單核細胞層，用高溫滅菌過的超純水裂解兩次，去除分離出的紅細胞，以及保留分離出的血 漿;采用高溫消毒滅菌的超純水去除紅細胞，可以避免回輸時紅細胞引起的負面作用。
[0014]步驟C，臍血有核凍存:收集細胞并計數和活率，按3X10%1/管進行冷凍保存;并 將細胞上清進行無菌檢測、支原體檢測，取5X106細胞做細胞表面標志檢測；
[0015] 步驟D，臍血單核細胞成分鑒定:臍血單個核細胞⑶34/CD45抗原表達及HSC-CFU培 養；
[0016]步驟E，臨床用臍血單核細胞使用：取冷凍細胞，復蘇后紅細胞會全部破碎，用生理 鹽水洗滌兩遍，統計細胞數和細胞活率，根據計數結果按臨床需要將細胞和復方電解質溶 液混勻待用;并留樣進行內毒素和細菌檢測。該凍存細胞復蘇后紅細胞會全部破碎，可以避 免回輸時紅細胞引起的負面作用。
[0017]優選地，步驟A中，所述分離獲得的臍帶通過篩選、采集健康足月產婦志愿者臍帶 獲得，所述篩選的檢測項目包括攜帶病毒或遺傳家族史。所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒 等。
[0018] 優選地，步驟A中，所述臍血保存袋只有標準量的血液抗凝劑，不含有血清培養基， 不含抗生素。可維持臍血活性長達24小時，避免了臨床應用時的抗生素過敏問題。
[0019] 優選地，步驟A中，所述臍帶置于臍血保存袋中4°C冷藏保存，并在24小時內進行分 離處理。
[0020] 優選地，步驟B中，所述兩步離心法采用醫用級別淋巴分離液。所述分離液成分明 確，符合臨床級別。
[0021]優選地，步驟C中，所述冷凍處理采用的細胞冷凍保護液由90%血漿和10%的二甲 基亞砜(體積百分比）配制而成，保護細胞活性。所述血漿為自體血漿。我們采用臍血本身血 漿作為凍存防護劑，可以避免其他動物源蛋白的影響，更符合臨床標準。
[0022] 優選地，步驟C中，所述無菌檢測包括用血培養儀進行細菌和真菌檢測;所述支原 體檢測包括用PCR法進行支原體檢測。
[0023] 本發明完全沒有使用外援蛋白質進行細胞處理。以及冷凍保護也用自體血漿，避 免不明動物源蛋白進入人體引起的潛在風險。
[0024] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0025] 1、全過程全面質量監控，從臍帶采集前的篩選開始直至細胞制備成成品中間品及 終產品的質量全部受控。
[0026] 2、無其他動物血清蛋白質等，不使用抗生素，避免異源蛋白及抗生素可能引起的 疾病或過敏風險。
[0027] 3、剔除所有紅細胞避免了回輸時紅細胞引起的負面作用。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明 的保護范圍。
[0029] 實施例1
[0030] 本實施例提供一種臨床用臍血單核細胞(富含造血干細胞)的制備方法，具體包括 如下步驟：
[0031] 步驟一、臍血篩選與保存:篩選、采集健康足月產婦志愿者臍帶(樣本1)，置于臍血 保存袋中4°C冷藏，并于24小時內進行分離處理；
[0032] 步驟二、臍血分離:將臍血通過兩步離心法去掉絕大多數紅細胞，分離出我們要的 單核細胞層，用高溫滅菌過的超純水裂解兩次，去除分離出的紅細