耐受性和固定率的微藻選育方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于微藻培育技術領域，涉及一種微藻的選育培育方法，特別是一種具有 高C02耐受性和固定率的微藻選育方法，能夠培養選育出高C0 2耐受性和固定率的微藻。
【背景技術】：
[0002] 自工業革命以來，人類向大氣中排入的二氧化碳等吸熱性強的溫室氣體逐年增 加，大氣的溫室效應也隨之增強，其引發的一系列問題已引起了全世界各國的關注。如何在 現有的燃料和能源結構條件下，采取經濟有效的方法控制co2的排放，是研究者多年來重點 研究的課題；根據眾多科學家的研究經驗和申請人近幾年的研究成果分析，微生物法是一 種行之有效的減排法，但是這其中所需的氫化細菌培養需要通入氫氣，實際工程應用中技 術復雜性較高，且微藻耐高溫性差，通常當〇) 2濃度大于5 %時生長就會受到抑制，固碳效率 也較低。因此選育出一種或幾種合適的微生物不僅能實現對高濃度co2高效減排以突破生 物法的技術瓶頸，而且所獲得的生物質還可通過質能轉化開發出新能源，以減少對化石燃 料的需求同時也減少了因化石燃料燃燒而引起的〇) 2的排放。
[0003] 查閱國內外典型研究成果發現，大部分微生物研究或是因為最適C02濃度和最高 耐受濃度較低、或是因為低固定率等原因都未取得滿意的結果；例如雖然劉玉環等人研究 的Scenedesmusdimorphus最適C02濃度和最高耐受濃度較高，但其在最佳濃度時的固定率 僅達0. 99gAL·d);黃和等人研究的"一株小球藻及其應用"（專利號為ZL201019026021. X)，其分離的小球藻M209256最高C02耐受濃度僅為24. 5 % (v/v)，最佳C0 2固定濃度為 5% (v/v)，15天最佳生物量為2. 23g/L，按通常的小球藻的含碳量50%計算，最佳C02固定 率為4.0888/1(折合0.2738八1^(1))，在0) 2濃度為24.5%&八）時0)2固定率為2.058/ L(折合0. 137gAL·(!));劉君寒等人研究的"一株小球藻及其培養方法和應用"（專利號為 ZL201110145547. 7)，該方法重點是獲得具有多功能的小球藻，其中所涉及的小球藻M4653 最高C02耐受濃度為30% (v/v)，優選在5% (v/v)C02時油脂含量為33. 5%和產量1.518/ 1^，在20%時僅為24.7%和0.798/1，顯然該小球藻不適宜在高〇) 2濃度環境下生存，且該方 法中也未對小球藻的適宜C02濃度和最佳C0 2固定情況進行闡述；李福利等人研究的"一株 柵藻及其培養方法和應用"（專利號ZL201110144545. 6)，該方法中僅僅闡述了柵藻M4653 可用于空氣（30% (v/v)C02環境），研究重點在于含氨氮等廢水的凈化及其油脂含量，但對 C02固定及去除情況未有提及，并且最佳生物質生長量出現在5% (v/v)C0jP最佳蛋白量出 現在3%(>八)〇)2時，可以理解為最高(1) 2耐受濃度為30%(>八)，最佳固定濃度僅為5% (v/V);因此需要研究設計一種新的具有較高C02耐受濃度和固定濃度的微藻，本發明的申 請人于2012年2月13日申請的專利號為ZL201210030297. 8中公開了一株具有高0)2耐 受性和固定率的微藻，并在說明書中給出了該株微藻的選育過程；但是該專利技術雖然公 開了具有高C02耐受性和固定率的微藻的選育試驗過程，但是其涉及的選育步驟過于簡單， 各種偶然因素過多，成功選育出穩定性較高的藻株幾率較低；因此本發明設計出一種能夠 選育出具有高〇) 2耐受性和固定率的微藻的方法，以便于產量化生產培育出具有高C〇2耐受 性和固定率的微藻，實現對煙道氣等高濃度復雜環境下C02的有效固定，對解決溫室效應問 題具有良好的應用價值和實際效益。
【發明內容】
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[0004] 本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點，設計一種專門用于選育高C02耐受 性和固定率微藻的方法，以實現高C02耐受性和固定率的微藻的量化選育培養。
[0005] 為了實現上述目的，本發明涉及的具有高C02耐受性和固定率的微藻選育方法具 體包括以下步驟：
[0006] (1)樣品的采集與預培養：
[0007] 采集土壤、池塘、自然河流、排污塘、電廠水塘中的水樣作為試驗樣品，培養前將上 述各水樣在光學生物顯微鏡下進行觀察，分別記錄所含微藻的種類；在反應器6中按1 :3 的容量比例加入所取樣品及已滅菌的BBM培養基，將微藻混合試樣接種到該培養基里，在 光照培養箱中進行培養，控制培養條件為：25°C±2°C，光照強度25000LUX，光暗比12 :12， 培養液初始pH值為6 ;預培養3周待明顯變綠后，按上述步驟繼續進行擴大培養，培養方法 同上；
[0008] ⑵模擬煙氣馴化培養
[0009] 將預培養后的微藻試樣裝入新的反應器6內進行馴化培養，將配制的含有體積比 為C0215 %、N283 %和022 %的模擬煙氣通入反應器中，控制氣流速度大于60mL/min，光照強 度為llOOOLux，光照周期為10h:14h，馴化培養4天；取馴化后的藻液接種到新的反應器6 的培養基中，依照上述方法反復馴化培養三次得高密度藻液，然后采用平板分離法進行微 藻分離試驗；
[0010] ⑶平板分離
[0011] 將上述高密度藻液接種在平板上，控制溫度21°C-25°C，光照強度25000LUX，光照 周期12:12,培養6-8天并觀察藻落生長情況；待單藻落形成時，挑取部分藻落在顯微鏡下 觀察，選取較多同一種屬的進行分離和采集；
[0012] (4)獲得純種群并進行保存
[0013] 將步驟（3)反復多次進行多代培養，直至單菌落特征一致，且顯微鏡下觀察為唯 一種屬時確定為純菌落藻種而進行保存；將純菌落藻種接種于斜面培養基中，放置于恒溫 培養箱中控溫4°C保存，1-2個月轉接一次，直至長出清晰藻落；
[0014] (5)培養特性測定
[0015] 按體積比1:9取對數生長期藻液接種到新的反應器6內已滅菌的BBM培養基中， 設置不同溫度、氣體流速、光照條件和培養基初始pH值一系列培養條件進行尋優試驗以得 出最佳培養條件；
[0016] (6)高強度馴化培養
[0017] 按體積比1:9取對數生長期藻液接種到新的反應器6內已滅菌的MBM培養基中， 分別在C02濃度為3%、5%、10%、15%、20%、30%、60%和80%及普通空氣條件下培養6天 時間，觀察微藻的生長情況，考察并記錄微藻對高濃度〇) 2的耐受性，以篩選獲得耐受性相 對高的菌株；
[0018](7)基因誘變育種
[0019] 根據致死率為70-80%有利于正向突變的原則，通過預實驗確定適合的誘變劑量 后進行紫外線誘變選育；選擇誘變劑量為紫外線照射30min，處理0D680nm分別為0. 020、 0. 031、0. 035、0. 046、0. 055和0. 088的藻液，并根據細胞致死率確定初始藻細胞濃度；上述 不同取值下〇D680nm的每個誘變試驗做3個平行樣后取其平均值，誘變后預培養同步驟（1) 的預培養過程，然后按照步驟（3)和（4)篩選出單株優良藻株；
[0020] (8)傳代穩定性測定
[0021] 將篩選得到的單株優良藻株分別接種入新的反應器6內新鮮培養液中連續培養 四代，并對第四代藻株測其生長曲線與第一代藻株比較，得到穩定突變株后再進行下個步 驟，否則重復步驟（7)和（8)直至得到穩定突變株；
[0022] (9)基因克隆和測序
[0023] ①菌液與質粒
[0024] 將得到的生長穩定的穩定突變株制成菌液，以大腸桿菌和PMG為質粒載體；
[0025] ②緩沖液及試劑
[0026] TAE：40mMTris-acetate, 10mMEDTA,
[0027] EB:lgEB溶于100ml蒸餾水中，放于棕色瓶中避光保存，
[0028] 試劑：植物基因組DNA提取試劑盒PlantGenomicDNAKit，普
[0029]通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒TIANgelMidiPurificationKit;
[0030] ③藻細胞DNA的提取
[0031] 取15ml對數生長期的菌株，在4300g下離心15min后轉接到離心管在-20°C條 件下凍結；取出離心管在室溫條件下溶解，在12000rmp離心30s，對沉底的組織進行物理 破碎；將65°C預熱的700μ1緩沖液GP1轉入離心管中迅速顛倒混勻后，放在65°C水浴中 20min，該過程中多次顛倒搖晃以混合樣品；加入700μ1氯仿充分混勾，在12000rmp下離心 5min;將所得上層水相轉入新的離心管中，加入700μ1緩沖液GP2充分混勻；將混勻的液 體轉入吸附柱CB3中，12000rmp下離心30s后棄掉廢液；向吸附柱CB3中加入500μ1緩沖 液⑶，12000rmp下離心30s后倒掉廢液，將吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加 入700μ1漂洗液PW，12000rmp下離心30s后倒掉廢液，將吸附柱CB3中放入收集管中；向 吸附柱CB3中加入500μ1漂洗液PW，12000rmp下離心30s后倒掉廢液；將吸附柱CB3中放 回收集管中，12000rmp下離心2min后倒掉廢液；將吸附柱CB3置于室溫放置，以徹底晾干 殘余的漂洗液；將吸附柱CB3轉入新的干凈離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μ1 pH值在7. 0-8. 5之間的水，室溫放置2-5min，12000rmp離心2min，將溶液收集到離心管中； 將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rmp離心