一種飼用釀酒酵母液固兩相發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及發酵領域，具體涉及一種飼用釀酒酵母液固兩相發酵方法。
【背景技術】
[0002]伴隨著我國畜牧業的飛速發展，釀酒酵母作為一種益生菌在畜牧行業中的應用越來越廣泛。然而目前釀酒酵母的生產主要才用液體發酵工藝，雖然發酵工藝比較成熟，但是也存在高耗能、易污染等問題，使用傳統固體發酵工藝生產釀酒酵母存在有效活菌數較低的問題。
[0003]液固兩相發酵法主要是通過液體發酵來獲取大量的種子液，然后再接種到固體培養基中進行發酵的工藝。這種工藝能有效的降低液體發酵在接種過程中的染菌風險，同時也改進了傳統固體發酵的接種方式，能夠縮短種子制備時間，同時還能夠發揮固體發酵的優勢，解決了高耗能、后處理困難等問題。同時通過液固兩相發酵所獲得的產品生產成本低、產品的耐受性較強。然而，液固兩相發酵工藝存在液體菌種不適應固體培養基的問題，液體菌種突然轉接到固體培養基后，由于傳質、傳能等沒有液體培養基那么方便，導致液體菌種很難適應固體培養基的環境，導致微生物的延滯期增加，可能導致發酵的失敗。
【發明內容】
[0004]本發明針對目前飼用釀酒酵母的液體發酵及固體發酵工藝的不足，優化發酵工藝，提供一種飼用釀酒酵母液固兩相發酵方法。該方法制得的飼用釀酒酵母有效活菌數高、雜菌率低、生產成本低。
[0005]根據本發明的飼用釀酒酵母液固兩相發酵方法包括以下步驟:
[0006](1)菌種活化及復壯；
[0007](2)斜面菌種制備
[0008]斜面培養基配方如下:麥芽汁12Bx、瓊脂2%、定容至lL，pH自然，
[0009]斜面培養基接入步驟(1)所活化菌種，其中釀酒酵母的接種量為試管中混合物總量的0.1%,于30°C條件下培養24h，制得斜面菌種；
[0010](3)500mL三角瓶菌種制備
[0011]配制液體培養基，培養基配方如下:麥芽汁12Bx，pH自然，
[0012]將液體培養基分裝在500mL三角瓶中，接入步驟(2)所制備的斜面菌種，其中釀酒酵母的接種量為0.1 %，于30°C、150?180r/min振蕩培養24小時制得液體種子；
[0013](4)1000mL三角瓶菌種擴大制備
[0014]配制液體培養基，培養基配方如下:麥芽汁12Bx，pH自然；
[0015]將配制的培養基分裝在1000mL三角瓶中，接入步驟(3)所制備的液體種子，其中釀酒酵母的接種量為10%，于30°C、150?180r/min振蕩培養24小時制得液體種子；
[0016](5)種子罐菌種制備
[0017]發酵罐之加入配方如下的液體培養基，培養基配方:取糖蜜加水稀釋至130L，開壓縮空氣攪勻，濃度為14Bx，加入營養鹽(NH4)H2P04l50g、(NH4)2S04250g、⑶(NH2)2150g、MgS04l50g、酵母抽提物450g、消泡劑400mL，
[0018]開啟發酵罐，當罐內降溫至31土 2°C，糖濃度為11?13Bx，S卩可接入步驟(4)制得的液體種子，于30°C通無菌風條件下培養24h，制得液體種子；
[0019](6)固體發酵
[0020]配制固體培養基，培養基配方如下:準確計量麩皮、玉米粉和酸化水，麩皮:玉米粉5?6:1，加水量為原料的50%，每50Kg干料加20mL濃硫酸，
[0021]固體培養基放入打料機，打碎，滅菌，
[0022]準確稱取固體發酵之所投加的大料量的2%的硫酸銨、1%的尿素，溶解并煮沸冷卻，1%的酶活為10萬單位的糖化酶，再將冷卻的營養鹽和酶液加入步驟(5)制得的液體種子液中，攪拌均勻，待固體培養基冷卻至40°C時，接入步驟(5)制得的液體種子液，接種量為10%v/m，將大料及液體菌種混合均勻后裝入淺盤，在32°C培養24h結束發酵，出料烘干粉碎制得成品。
[0023]根據本發明的【具體實施方式】，本發明的飼用釀酒酵母液固兩相發酵方法包括以下步驟:
[0024](1)菌種活化及復壯
[0025]將保存的釀酒酵母(菌種保藏編號ACCC20065)凍干管菌種用無菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10—8時，在固體平板培養基中進行劃線分離進行培養，24小時后挑取單菌落再次進行劃線分離培養，得到單菌落。
[0026](2)斜面菌種制備
[0027]斜面培養基配方如下:麥芽汁12Bx、瓊脂2%、定容至lL，pH自然；
[0028]將斜面培養基加熱溶解，再進行試管分裝并密封;將試管于121°C、0.15MPa條件下滅囷30min，取出冷卻備用；
[0029]將上述斜面培養基接入步驟(1)所制備的菌種，其中釀酒酵母的接種量為試管中混合物總量的0.1%，于30°C條件下培養24h，制得斜面菌種。
[0030](3)500mL三角瓶菌種制備
[0031]按照配方要求配置液體培養基，培養基配方如下:麥芽汁12Bx，pH自然；
[0032]將上述培養基分裝在500mL三角瓶中，裝瓶量為1 OOmL，于121°C、0.15MPa條件下滅菌30min，冷卻到30°C時接入步驟(2)所制備的菌種，其中釀酒酵母的接種量為0.1%，于30°C、150?180r/min振蕩培養24小時制得液體種子；
[0033](4)1000mL三角瓶菌種制備
[0034]按照配方要求配置液體培養基，培養基配方如下:麥芽汁12Bx，pH自然；
[0035]將上述培養基分裝在1000mL三角瓶中，裝瓶量為200mL，于121°C、0.15MPa條件下滅菌30min，冷卻到30°C時接入步驟(3)所制備的菌種，其中釀酒酵母的接種量為10%，于30°C、150?180r/min振蕩培養24小時制得液體種子；
[0036](5)種子罐菌種制備
[0037]按照配方要求配置液體培養基，培養基配方如下:取糖蜜加水稀釋至130L左右，開壓縮空氣攪勻，濃度為14Bx左右即可，加入營養鹽(NH4)H2P04l50g、(NH4)2S04250g、C0(NH2)2l50g、MgS0U50g、酵母抽提物450g、消泡劑400mL;
[0038]開啟發酵罐上部彎管排汽閥與蒸汽進汽閥。關閉其它通往罐內外的閥門，當料液煮沸后，關排汽閥至排微量汽，升壓至0.05?0.1MPa，保壓30?40min ；
[0039]當罐內降溫至31±2°C，糖濃度為11?13Bx，即可接入步驟(4)制得的液體種子，于30°C通無菌風條件下培養24h，制得液體種子；
[0040](6)固體發酵
[0041]按照配方要求配置固體培養基，培養基配方如下:準確計量麩皮、玉米粉和酸化水，麩皮:玉米粉5?6:1，加水量為原料的50%，每50Kg干料加20mL濃硫酸；
[0042]固體培養基放入打料機，打碎，勻后裝入蒸料鍋中，滅菌時裝料疏松，常壓滅菌2.5小時左右；
[0043]準確稱取大料投料量2%的硫酸銨、1%的尿素(加約30L水溶解并煮沸冷卻待用)，1%的酶活為10萬單位的糖化酶，再將冷卻的營養鹽和酶液加入步驟(5)制得的液體種子液中，開風攪拌均勻，將固體培養基中添加糖化酶和營養鹽，幫助液體菌種快速適應固體培養基，為微生物提供碳源及無機鹽等；
[0044]待固體培養基冷卻至40°C時，接入步驟(5)制得的液體種子液，接種量為10% (v/m)，將大料及液體菌種混合均勻后裝入淺盤，在32°C培養車間培養24h結束發酵，出料烘干粉碎制得成品；
[0045]進一步，所述步驟(6)中糖化酶應先置于40°C無菌水中活化1小時；
[0046]進一步，所述步驟(6)中淺盤裝樣要求厚度為2?3cm，疏松均勻，同時在發酵過程中需要對淺盤中的物料進行翻料2次；
[0047]進一步，所述步驟(6)培養過程中控制品溫29?34°C，在開始培養前應將室溫升至26?32°C，前期保濕培養，夏天可以地面灑水增濕，冬天采取放蒸汽增濕，當品溫較高，開啟風機，并翻料，旺盛生長期應一小時內至少翻料兩次，后期緩慢排朝，以利于干燥。在控制過程中要以室溫來控制品溫，要以酵母生長的溫度趨勢做好提前量的控制。
[0048]根據本法的發酵方法能有效的降低液體發酵在接種過程中的染菌風險，成品雜菌率為0.5%，同時也改進了傳統固體發酵的接種方式，能夠縮短種子制備時間，同時還能夠發揮固體的優勢，解決了高耗能、后處理困難等問題。同時通過液固兩相發酵所獲得的產品生產成本低、產品的耐受性較強。同時通過發酵培養基的優化，提高了發酵成品有效活菌數，可達100億/克。
【具體實施方式】
[0049]下面通過實施例作進一步描述。
[0050]實施例1[0051 ] 一、發酵試驗
[0052]采用液固兩相工藝發酵釀酒酵母制備飼料添加劑，具體步驟如下:
[0053](1)菌種活化及復壯
[0054]將保存的釀酒酵母(菌種保藏編號ACCC20065)凍干管菌種用無菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10—8時，在固體平板培養基中進行劃線分離進行培養，24小時后挑取單菌落再次進行劃線分離培養，得到單菌落。
[0055](2)斜面菌種制備
[0056]斜面培養基配方如下:麥芽汁12Bx、瓊脂2%、定容至lL，pH自然；
[0057]將斜面培養基加熱溶解，再進行試管分裝并密封;將試管于121°C、0.15MPa條件下滅囷30min，取出冷卻備用；
[0058]將上述斜面培養基接入步驟(1)所制備的菌種