用于培養鐵皮石斛褐斑病菌的含有特異氨基酸的培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物領域，特別的，屬于采用培養方法來培養鐵皮石斛褐斑病菌的 培養方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑節草、云南鐵皮，是蘭科(Orchidaceae)多年生 附生草本植物，是一種珍貴的中藥材。早在《神農本草經》中就有記載，具有滋陰清熱、生津 益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮痛消炎的功效。同時現代研究表明，石斛藥材除具有本草記載 的等功效外，還具有抗腫瘤、抗輻射、抗血小板凝集及增強機體免疫力等功效。近年來石斛 藥材的需求量不斷增加，而栽培技術的不斷創新使得人工種植石斛的面積不斷增大，然而 隨著集中種植面積的增加，出現的問題也不斷增多，石斛種植出現多種不同的病害，例如鐵 皮石斛褐斑病。石斛葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后小點漸漸擴大為約5~ 6mm的病斑。這不僅影響石斛的品質，也影響石斛的產量，具統計褐斑病導致產量損失5 % -10%。防止褐斑病的發生和擴增有助于提高石斛生產的產量和品質，確保石斛產業健康有 序的發展。為了研究如何防治鐵皮石斛的褐斑病，就需要首先培養褐斑病來進行一些方面 的研究，例如研究該病菌的生物學特性，藥效試驗等篩選出合適的藥物進行防治。但是，這 種病菌難以培養，而且產量低，為此，需要提供如何高效率的培養褐斑病病菌進行相關方面 的研究。
【發明內容】
[0003] 為了解決以上問題，本發明提供一種培養鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括： 提供草莓煎汁培養基，其中該草莓煎汁培養基的組成為:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g， 添加水至l〇〇〇ml。
[0004] 優選的，草莓莖葉200g經過如下過程進行制備：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和 200g草莓莖葉，煮沸5min后，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0005] 優選的，培養的PH值為7.
[0006] 優選的，培養的溫度為25-30攝氏度。
[0007] 優選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多P彖莖點霉（Phomamultirostrata (Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0008] 另一方面，本發明提供草莓煎汁培養基在制作培養鐵皮石斛褐斑病菌培養基中的 用途，其中所述的草莓煎汁培養基由下列組分組成:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g。
[0009] 優選的，優選的，草莓莖葉200g經過如下過程進行制備:在煎鍋中放入1000mL蒸餾 水和200g草莓莖葉，煮沸5min，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0010] 優選的，培養的PH值為7。
[0011]優選的，培養的溫度為25-30攝氏度。
[0012]優選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點霉（Phomamultirostrata (Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)〇
[0013] 另一方面，本發明提供一種培養鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括提供一種 培養基，該培養的組成如下：氮源化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯 化鉀0.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質30g，瓊脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物質 為麥芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0014]優選的，糖源物質為纖維乙糖。
[0015]優選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸 鉀。
[0016]優選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0017] -種培養基在用于制備培養鐵皮石斛褐斑病菌培養基中的用途，其中，所述的培 養基的組成如下:氮源(氨基酸)化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯化 鉀〇.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質30g，瓊脂20g，其中所述的糖源物質為麥芽糖、蔗糖、菊 糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0018]優選的，糖源物質為纖維乙糖。
[0019]優選的，所述的氨基酸化合物為L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。
[0020]優選的，所述的氨基酸化合物為L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0021]優選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點霉（Phomamultirostrata(Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0022] 有效效果
[0023]通過本發明的特異培養基和培養方法，可以獲得優質、大量的褐斑病菌，為研究褐 斑病菌提供了有益的材料，特別是可以提供大量的孢子。
[0024]具體實施例子
[0025] 1材料與方法
[0026] 1.1鐵皮石斛褐斑病病樣采集及病原菌的分離
[0027]田間鐵皮石斛褐斑病病樣采集于浙江省樂清縣雁蕩山鎮的樂清鐵楓堂鐵皮石斛 基地、樂清同豐鐵皮石斛基地、樂清靈巖鐵皮石斛基地;采樣后將標樣放入保鮮袋帶回實驗 室置于5°C冰箱，待用。切取鐵皮石斛褐斑病鏡檢并用PSA培養基分別于進行常規組織分離 和劃線分離。
[0028] 1.2致病性測定
[0029]分別采用分離自鐵皮石斛褐斑病病樣分離物的菌絲和分生孢子液(稀釋成IX106 個/mL)，對石斛進行嫩枝活體傷口和無傷接種，在25°C的XT5401-CD275TJH智能生物人工氣 候箱內，RH98%以上，12小時光照12小時黑暗接種后培養，以健康的枝條為對照，重復3次， 每天定時觀察記錄發病情況，分析致病性。
[0030] 1.3病原菌的培養性狀
[0031] 病原菌接種于PSA上于25°C培養7d，記錄菌落形態，顏色;測量100個分生孢子的大 小，
[0032]重復3次，記錄平均值。
[0033] 1.3.1不同培養基對鐵皮石斛褐斑病病原菌菌絲生長及分生孢子產生的影響。
[0034]病原菌于25°C用下表中的培養基培養，每處理重復6次，5d后測量菌落直徑，菌絲 干重、分生孢子器的產生情況、及其菌落色澤等。
[0035] 表1:不同培養基的配方
[0036]
[0037] *煎汁培養基的準備過程：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和200g相應的物品，煮沸 5min后，過濾留濾液，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0038] 1.3.2，針對最優選的培養基(草莓煎汁培養基），我們確定不同pH值對鐵皮石斛褐 斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.0mm的菌絲塊移于pH值4-12的不同pH值的草莓 煎汁培養基上(pH值采用pHS-9V酸度計測量配制），置于25°C培養，每處理重復6次，6d后測 量菌落干重，計算分生孢子數量。
[0039] 1.3.3不同溫度對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.0mm的 菌絲塊移于草莓煎汁培養基平板上，置于5°C，10°C，15°C，20°C，25°C，30°C，35°C不同溫度 下培養，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑和分生孢子數量。
[0040] 1.3.4不同碳源對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0041]經過我們的大量研究，發現，當以草莓煎汁培養基來研究最佳碳源和氮源對該病 菌培養的影響的時候，發現不同的碳源對培養的性狀(菌落干重和產孢情況)并沒有實質的 差異，也就是說不同的碳源或氮源似乎起到同樣的作用，沒有實質的改善和影響，同樣，在 其他類似的培養基上，例如樹皮煎汁培養基，甘蔗煎汁培養基，荷葉煎汁培養基，燕麥培養 基(0MA培養基)獲得與草莓煎汁培養基類似的結果(具體數據略）。
[0042]相反，查氏培養基為基礎培養基，再分別用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳 糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纖維素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳 糖、麥芽糖、纖維素鈉、纖維乙糖等20種不同碳源等量置換蔗糖(含量與蔗糖一樣），于25°C 下培養，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產孢情況，獲得了不同的結 果，具體見結果分析。
[0043] 1.3.5不同氮源對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0044]以查氏培養基為基礎培養基，分別用谷氨酸、谷氨酰氨、天門冬酰氨、天門冬氨酸、 甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪 蛋白水解物、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉等26種氮源等量置換硝酸鉀或硝酸鈉(質量與 硝酸鉀一樣），置于25°C培養，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產孢情 況。
[0045] 2.0結果與分析
[0046] 2.1鐵皮石斛褐斑病的癥狀
[0047]褐斑病僅侵染鐵皮石斛的葉片。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后 小點漸漸擴大，最大病斑約5~6mm。病斑圓形或橢圓形，淡褐色至黑褐色，有時病健交界處 常有一圈褐色的暈圈。病斑中間凹陷。嚴重時，葉片上出現許多大小不一的病斑，一般新葉 不染病。
[0048] 2.2病原菌的分離和致病性測定
[0049]對幾十個石斛褐斑病標樣進行劃線分離和常規組織分離，5d后，培養皿上長出少 量細菌和不同的真菌，將這些細菌和真菌置于適宜的溫濕度條件下對在相同鐵皮石斛健康 的枝葉進行柯赫法則檢驗，發現這些細菌大都為芽孢桿菌，均為非致病菌;其中重復分離到 的一種真菌分離物為疑似病原物。將這種真菌分離物置于適宜的溫濕度條件下在相同鐵皮 石斛健康的枝葉進行接種檢驗，這些真菌分離物均對石斛葉致病，發病病癥與田間基本一 致，通過分子生物方法鑒定為即為石斛褐斑病病原菌。
[0050] 2.3病原菌分離物的形態及培養性狀
[0051]病原菌在PSA上，菌絲成放射狀生長，氣生菌絲灰白色，短絨毛狀，較發達。平鋪于 培養基上，初期菌落(尤其在其邊緣)為淡淡的粉紅色，隨即轉為灰色，再由灰色轉為褐色， 最后由褐色轉為黑褐色，菌落也