一種依諾肝素鈉精品的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，特別是一種精品依諾肝素鈉的制備和純化工藝。
【背景技術】
[0002]依諾肝素鈉的生產工藝，現國內外已經有多篇文獻的報道。其中一個重要的生產工藝，即依諾肝素鈉的精制，國內外相關文獻報道的卻不盡相同，主要問題有一下三點:(1)依諾肝素鈉粗品的脫色問題，相關文獻中有使用大孔吸附樹脂、活性炭吸附脫色、雙氧水氧化脫色等。(2)依諾肝素鈉粗品分子量與分子量分布作為一項低分子肝素的最為重要的指標相關文獻報道較少，且主要集中于使用超濾的方法來進行調節和控制。(3)依諾肝素鈉成品制備環節，相關文獻報道中有使用醇沉淀、冷凍干燥等方法，以上方法不能很好的解決依諾肝素鈉精品生產問題。
【發明內容】
[0003]針對上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種依諾肝素鈉精品的生產方法，該方法使用肝素鈉粗品為原料即可得到質量較好的依諾肝素鈉精品并取得較高的收率，實現了依諾肝素鈉低成本、高效率的工業化生產。
[0004]本發明提供的一種制備依諾肝素鈉原料的工藝，其包括如下步驟:
(1)低分子肝素鈉粗品的制備取肝素鈉粗品加入純化水溶解。調節溶液pH至2.7-3.0，加入亞硝酸鈉，保持溫度在15-30°C攪拌15min，再調節溶液pH至10.0-10.4，加入硼氫化鈉攪拌2 15h，鹽酸調節溶液pH至3.5-4.0攪拌15min。氫氧化鈉調節溶液pH7.2-7.8，254nm紫外燈光照射降解20-25min，加入乙醇沉淀，靜置8h以上，沉淀后的固體再脫水后放入真空干燥箱中，60-65°C干燥40-48h，得到低分子肝素鈉粗品。
(2)低分子肝素鈉精品制備將上述低分子肝素鈉粗品用2%氯化鈉溶液溶解后加入層析柱內，以2%氯化鈉溶液勻速洗拓，接收溶液，測定每一杯的紫外0D200光吸收值，根據數值繪出圖譜。借助HPLC測試的分子量及分布數據，確定需通過凝膠層析除去的大、小分子百分比數，通過公式計算出相對應的面積及相對應體積。收集需要的溶液部分并調節pH至7.2-7.8,乙醇沉淀靜置? 8h，脫水后的濕固體60-65°C真空干燥18-24h。
(3)混合溶解將分批層析出的低分子肝素鈉精品合并，測試其分子量及分布，如果小分子部分有偏差，可調節溶液PH7.2-7.8，加入乙醇沉淀對小分子片段進行調節，使其達到符合要求。將分子量及分布合格的低分子肝素鈉精品加入氧化罐內，加入純化水和氯化鈉，攪拌溶解。
(4)雙氧水氧化調節上述氧化罐內溶液pH1.0-10.4，加入30 %過氧化氫氧化4h。結束后調節PH7.2-7.8，加入無水亞硫酸鈉攪拌30min后過濾，得到依諾肝素鈉溶液。
(5)除菌過濾調節依諾肝素鈉粗品溶液pH5.0-5.5，將0.45μπι和0.2μπι濾膜串連，0.45μ??端口和氧化罐出口相連，打開反應罐出口閥門，使罐內液體依次通過0.45μπ?和0.2μπ?過濾膜，除菌過濾后的依諾肝素鈉溶液收集在潔凈沉淀罐中。 (6)依諾肝素鈉精品的制備過濾后的依諾肝素鈉溶液加入乙醇沉淀靜置2 8h以上。后過濾并用乙醇脫水、離心機脫水真空干燥得到精品依諾肝素鈉。
[0005]【具體實施方式】為了使本技術領域的人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明。
[0006]實施例1
(1)低分子肝素鈉粗品的制備
加入100L水和肝素鈉粗品9kg至反應罐內，攪拌使其完全溶解，用4mol/L鹽酸調節罐內溶液pH值為2.7，稱取0.18kg亞硝酸鈉加入燒杯中，向燒杯中加入1500mL純化水，攪拌溶解后，加入反應罐內，維持罐內溶液pH值為2.7-3.0，攪拌反應15min后用淀粉-碘化鉀試紙測試溶液，觀察試紙顏色，直至試紙不顯藍色為止。用5mol/L氫氧化鈉溶液調節體系pH值為10.0，加入0.09kg硼氫化鈉至反應罐內，攪拌反應16h，再用4mol/L鹽酸調節溶液pH值為3.6，攪拌15min。再用5mol/L氫氧化鈉溶液調節體系pH值至7.5，將波長254nm的紫外燈接通電源，放入反應罐內照射20min，溶液體積為135L，將95L乙醇緩慢倒入反應罐內，邊加邊攪拌，充分攪拌均勻，沉淀13h，倒去上清液，沉淀物中再加入52L乙醇脫水，攪拌2.5h倒去上清液，沉淀物再加入29L乙醇脫水，2.5h后倒去上清液，沉淀物再加入16L乙醇脫水，2.5h后倒去上清液，將脫水后的濕固體裝入不銹鋼盤中，放入真空干躁箱60-65°C干燥45h，對降解物稱重得到6.79 kg低分子肝素鈉粗品，收率75.44% dPLC分子量及分布:分子量為5550〉8000部分為20.00%(應10.0-30.0%)，〈3000部分9.5%(應$30.0%)，^勵殘留〈0.25??111(應 S0.25ppm)。
[0007](2)凝膠柱層析稱量1.8kg氯化鈉溶入純化水中，攪拌溶解使最終體積為90L，得至Ij2%的氯化鈉溶液，稱量降解后的低分子肝素鈉粗品0.4kg，加入2%的氯化鈉溶液，攪拌溶解使最終體積為3200mL，調節溶液pH為7.5，打開恒流栗，用2 %的氯化鈉溶液平衡層析柱1-2.5h，平衡流速為140mL/min，平衡完畢，當氯化鈉溶液流淌至凝膠界面上l-2cm處，關閉恒流栗及出水閥。將溶解后的溶液用恒流栗緩緩加入層析柱內，初加時流速不可過快，防止破壞凝膠界面的平整。當溶液加至凝膠界面之上5cm左右時，打開出水閥，同時加快加樣的流速，直至樣品加完。當低分子肝素鈉粗品溶液流淌至凝膠界面上l-2cm處時，開始接樣。同時用恒流栗小心緩慢栗入2 %氯化鈉溶液。共接收60杯溶液，總體積30L，根據HPLC分子量及分布，總面積63.20，大分子部分約為1.545，小分子部分面積約9.955。通過公式計算除去的大分子部分面積為2.14%，體積為4.5L，計算除去的小分子部分面積為15.66%，體積為8.5L，這樣中間收集部分面積約53.223，占總面積82.30%,體積17.00L，因此需去掉前9杯和后17杯。向收集的中間17.00L洗拓液中加入34L乙醇，邊加邊攪拌，充分攪拌均勻，沉淀靜置15h，倒去上清液，沉淀物中再加入36.1L乙醇脫水，攪拌2.5h倒去上清液，沉淀物再加入18.05L乙醇脫水，2.5h后倒去上清液，沉淀物再加入9.03L乙醇脫水，2.5h后倒去上清液，將脫水后的濕固體裝入不銹鋼盤中，放入真空干躁箱60?65°C干燥48h，稱重得到低分子肝素鈉精品0.292kg，收率73.00%。用上述層析法將另外6.39kg的低分子肝素鈉純化出來，共得到低分子肝素鈉精品4.89kg，收率76.50%。<