一種穿膜多肽與抗腫瘤藥偶聯物的制備及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及一種多肽與抗腫瘤藥偶 聯形成一種新藥物，該多肽本身不具有生理活性，但是具有透過血腦屏障的作用，本發明還 涉及該多肽的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 腦瘤及腦轉移瘤的發病率逐年上升。在對其治療方面，血腦屏障被認為是阻止化 療藥物進入腦組織進而影響療效的主要原因。血腦屏障是機體參與固有免疫的內部屏障之 一，由介于血循環與腦實質間的軟腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質膜所組 成，能阻擋病原生物和其他大分子物質由血循環進入腦組織和腦室。基本上100%的大分子 藥物，包括多肽、重組蛋白、單克隆抗體、基于RNA干擾技術的藥物、基因治療相關藥物等都 無法穿越血腦屏障，且大于98 %的小分子藥物也無法穿過血腦屏障。目前，放射性治療與 化學療法只能延長患者生命4個月，因此本發明致力于研究使現有藥物更好的透過血腦屏 障。
[0003]多肽由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內有較高的利用度，由于本身 是內源性物質所以毒性小，但是多肽直接作為藥物受到較大的限制，例如其穩定性差，不能 口服。近年來，多肽作為藥物輔助功能的應用逐漸成為了新藥研制的熱點之一。細胞穿膜肽 是20世紀中期開始認識到的一類具特殊功能的多肽分子，英文學術名稱一般寫為cell2-p enetrating-peptides(CPPs)。它們通常由5~30個氨基酸組成，典型的一般由8~16個氨 基酸構成，具有生物膜穿透功能，還可攜帶其它分子甚至超分子顆粒進入細胞中。正是因為 這種特殊的功能，它們被看作生物活性分子有效的細胞內轉運工具，具有廣泛的應用前景。
[0004] 近些年來多肽和藥物通過共價方式形成組合物的例子很多，例如：多肽 Penetratin和阿霉素共價耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價耦合用于治療眼 癌轉移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價耦合治療乳腺癌。
【發明內容】
[0005] 以下是本發明的詳細描述：
[0006] (1)本發明所述的穿膜肽
[0007] 本發明所述的細胞穿膜肽，由13個氨基酸組成，而且是親水性和疏水性交替組合 的，氨基酸序列為：SEQIDN0 :1。
[0008] (2)本發明所述的穿膜肽的制備方法
[0009] 本發明所需多肽是采用固相的方法制備的，固相合成是以固相載體樹脂為載體， 從C端即羧基端向N端即氨基端逐漸添加氨基酸的過程。
[0010] 本發明中優選樹脂：Fmoc-wang樹脂、2-cl-trt樹脂，樹脂取代度0. 24~0. 4。
[0011] 本發明所使用的保護氨基酸為：Fmoc-Arg(pbf)-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Val-〇H， Fmoc-Trp-〇H，反應過程中保護氨基酸3~5倍過量。
[0012] 本發明所使用的脫保護試劑為：哌啶/N，N_二甲基甲酰胺，比例為10:90~ 30:70。
[0013] 本發明所使用的偶聯試劑為：①苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν'-四甲基脲六氟磷酸鹽 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑）-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 /1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，③Ν，Ν' -二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)。
[0014] 本發明中，若使用第①或者第②種偶聯試劑，那么反應中過程中應添加縛酸劑： DIEA/NMPo
[0015] 本發明中所使用的切割試劑為：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比例 為：82· 5:5:5:5:2. 5〇
[0016] 本發明中所使用MS-IT-T0F確定分子量，使用HPLC純化粗肽。
[0017] (3)本發明所述多肽與抗腫瘤藥物阿霉素的連接方法
[0018]
[0019] 首先阿霉素與酸酐反應，在阿霉素分子上構建羧基；再將多肽片段的末端氨基與 上述分子上的羧基反應，生成偶聯物；最后分離純化偶聯物。
[0020] (4)本發明所述多肽與抗腫瘤藥物紫杉醇的連接方法
[0021]
[0022] 首先紫杉醇與酸酐反應，在紫杉醇分子上構建羧基；再將多肽片段的末端氨基與 上述分子上的羧基反應，生成偶聯物；最后分離純化偶聯物。
【附圖說明】
[0023] 附圖1:革巴向肽的液相純度譜圖
[0024] 附圖2:靶向肽的液相純度譜圖
【具體實施方式】
[0025] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0026] 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0027] 實施例1:多肽的固相合成
[0028] 使用Fmoc策略的固相多肽合成方法（使用的氨基酸購自上海吉爾公司），使用 CEM公司生產的Liberitity型儀器進行本發明的穿膜多肽的合成。操作方法按照生產商的 儀器說明書進行。
[0029] 合成所用試劑選擇：
[0030] (1)載體樹脂：Fmoc-Arg(pbf)-wang-rink，替代度：0· 33〇
[0031] (2)所選用的保護氨基酸：Fmoc_Arg(pbf)-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Val-OH， Fmoc-Trp-〇H，反應中所用保護氨基酸5倍過量。
[0032] (3)本發明所使用的脫保護試劑為：哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，比例為20:80。
[0033] (4)本發明所使用的偶聯試劑為：Ν，Ν'-二異丙基碳二亞胺（DIO/1-羥基苯并三 唑（Η0ΒΤ)。
[0034] (5)本發明中所使用的切割試劑為：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比 例為：82. 5:5:5:5:2. 5。
[0035] 將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱（購自Phenomenex公司）進行純化，檢測 條件為：檢測波長：214nm，流動相A:乙腈（含0. 1 %三氟乙酸），流動相B:水（含0. 1 %三 氟乙酸），洗脫條件：30分鐘內由35 %A~50 %A，利用MS-IT-T0F確定所得純品分子量， 用HPLC確定樣品純度（液相純度譜圖見附圖1)，純度大于95%經脫鹽及冷凍干燥得到多 肽凍干粉。
[0036] 實施例2:腦靶向肽與抗腫瘤藥物阿霍素的偶聯物
[0037] 化合物II的合成
[0038] 50m反應瓶中加入L0g(1.72mmol)阿霉素，0.52g(5.20mmol) 丁二酸酐，30mlTHF， 滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二異丙基乙胺（DIEA)，27°