一種利用溶劑分級結晶分離蝦青素單雙酯的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于天然產物分離技術領域，具體涉及一種利用溶劑分級冷卻結晶制備蝦 青素單酯和蝦青素雙酯的方法。 技術背景
[0002] 蝦青素以8七31311讓丨11，3,3'-二羥基-4,4-二酮基-0，0'-胡蘿卜素），是一種紅色酮 式類胡蘿卜素，發現于某些水生動物體內。據報道，蝦青素的抗氧化性比β-胡蘿卜素高10倍以 上，比維生素Ε高500倍以上，被稱為"超級維生素Ε"。蝦青素可作為著色劑應用于貴重水產 品及禽類養殖以增加其附加商品值，此外，人體也可選擇性積累蝦青素，有抗氧化、抗衰老、 抗腫瘤、預防心腦血管疾病等功效。因此近年來受到廣泛關注。
[0003]因蝦青素具有抗氧化、抗炎、著色、光保護、促進繁殖等多種生物學功能，近年來甚 受國內外的食品、醫藥、化妝品、水產養殖等行業的關注。研究發現，在自然界中蝦青素90% 以上以酯化形式存在，酯化蝦青素較游離蝦青素穩定。并且大多產品的制備、儲存和應用均 以蝦青素酯的形式進行。蝦青素、酯化蝦青素的結構如圖1所示。
[0004] SHOWALTERLA，CARD0UNEL1AJ，WADEAΝ等研究表明，隨著蝦青素酯化程度的加 深，蝦青素體現為疏水性增強，且更容易被動物組織所吸收利用。在對龍蝦等動物的研究 中，就證實酯化蝦青素比游離蝦青素容易被吸收并與外骨骼結合，從而使動物有效著色。特 別值得關注的是，酯化蝦青素的形態對其穩定性和吸收利用率具有重要影響，Harukazu FUKAMI等研究表明，單酯形式的類胡蘿卜素和雙酯形式的類胡蘿卜素在消化吸收特性方面存 在差異。因此，探索一條高效純化制備蝦青素單酯和蝦青素雙酯的工藝路線，對于研究不同 結合形態的蝦青素在理化性質和消化吸收特性差異性具有重要意義，并且為蝦青素單酯和 雙酯的開發應用奠定基礎。
[0005]本發明提供一種利用溶劑分級結晶純化蝦青素單酯和雙酯的方法，對蝦青素研究 與應用推廣，以及帶動藥保健品、水產養殖業以及家禽業等各方面的發展，具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明提供一種利用溶劑分級冷卻結晶分離蝦青素單酯和蝦青素雙酯的方法，能 夠有效的將蝦青素單酯和蝦青素雙酯從提取的蝦青素酯中分離出，從而彌補現有技術的不 足。
[0007]本發明的方法，包括有如下的步驟：
[0008] 1)將蝦青素酯粗提物加入到無水乙醇中，在50~70°C條件下攪拌，至充分溶解，然 后將上述溶液體系置于35~38°C條件下靜止放置1~6h，然后經離心或過濾，收集清液；
[0009] 2)將步驟1)收集得到的清液或濾液置于18~28°C條件下靜止放置1~6h，然后經 離心或過濾，收集析出物；
[0010] 3)將步驟2)得到的析出物利用乙醇溶液洗滌1~3次，然后對析出物進行干燥，得 到蝦青素雙酯，洗滌液經回收循環利用；
[0011] 4)將步驟2)得到的離心清液或濾液置于4~15°C條件下，靜止1~6h后進行離心或 過濾，收集析出物，所得清液或濾液返回步驟1或經減壓回收重復利用；
[0012] 5)將步驟4)收集得到的析出物利用乙醇溶液洗滌1~3次，然后經干燥得到蝦青素 單酯。
[0013]所述的蝦青素酯粗提物的制備方法如下：
[0014] 以雨生紅球藻、南極磷蝦、對蝦、蟹為原料，以乙醇、乙酸乙酯和正己烷中的一種或 幾種作為提取溶劑，按照料液比為1:3~20浸提1~24h，浸提結束后，經過濾或離心收集浸 提液，然后浸提液經減壓濃縮至無溶劑流出，回收浸提溶劑，得到的濃縮物即為蝦青素酯粗 提物。
[0015] 步驟3)所述洗滌用乙醇溶液為無水乙醇或體積分數70~95%的乙醇水溶液，并且 洗滌用溶液的溫度在15~20°C。
[0016] 步驟5)所述洗滌用乙醇溶液為無水乙醇或體積分數70~95%的乙醇水溶液，并且 洗滌用溶液的溫度控制在4~10°C。
[0017]本發明選用的溶劑飽和低級脂肪醇，是相對極性較強的溶劑，在適當加熱的條件 下對蝦青素酯粗提物中各組分具有較好的溶解性，而隨著溫度的降低，對不同極性的組分 的溶解度變化差異較大，若在醇中加入適量的水，則可使溶劑的極性發生變化，更有利于蝦 青素酯的分離，而且，由于甘油和水的無限混溶性，使得蝦青素酯粗提物中的甘油更容易被 除去，同時，水的存在更利于除去體系中的高極性雜質，如：葉綠素及其鹽，脂肪酸鹽等。而 醇對脂肪酸具有良好的溶解性，使得脂肪酸也可被除去。由此可見，利用飽和低級脂肪醇的 復合溶劑對蝦青素酯粗提物進行分級結晶分離，可獲得良好的分離效果。本工藝流程簡單， 無污染，易于工業化。
【附圖說明】
[0018] 圖1:蝦青素、蝦青素單酯及蝦青素雙酯的結構圖，其中R為飽和或不飽和的烴鏈；
[0019] 圖2:本發明的工藝流程圖；
[0020] 圖3:實施例2產物的TLC分析圖，其中1:雨生紅球藻粗提物，2:奸青素雙酯組分;3: 蝦青素單酯組分；
[0021] 圖4:實施例2產物的HPLC-DAD分析圖。
【具體實施方式】
[0022] 申請人在長期的研究中發現，通過控制冷析溫度能夠使蝦青素酯粗提物中大部分 的甘油酯析出，而只有少量的蝦青素酯析出，從而達到從蝦青素酯粗提物中除去甘油酯的 目的;進一步通過控制冷析溫度，可使蝦青素二酯和蝦青素單酯分級析出。
[0023] 以下采用實施例來詳細說明本發明的實施方式，借此對本發明如何應用技術手段 來解決技術問題，并達成技術效果的實現過程能充分理解并據以實施。蝦青素單酯和雙酯 的定性定量分析：
[0024]本發明采用薄板層析法和高效液相色譜法對蝦青素酯粗提物在分級結晶分離過 程中的各組分析出物進行定性、定量分析檢測。
[0025]TLC分析
[0026] 實驗步驟：準確稱取10 .Omg樣品，加入10ml二氯甲烷溶解，震蕩提取lOmin;在 6000r/min條件下離心30min，取上清液點樣；以正己燒:丙酮=4:1(V/V)配制展開劑60ml， 置于展開槽中平衡；以Φ3_的點樣毛細管點樣，展開，其間觀察并記錄現象。
[0027] HPLC分析
[0028] 準確稱取2.Omg樣品，加入10ml色譜純二氯甲烷溶解，經0.22μπι有機膜過濾，然后 進行HP