肌醇六磷酸酶的制作方法
【專利說明】肌醇六磷酸酶
[0001] 序列表
[0002] 本申請正在經由USPTO EFS-WEB服務器電子提交，如在MPEP § 502. 05中所批準并 闡明的，并且此電子提交包括電子提交的序列表；該序列表的全部內容在此通過引用并入 本申請的說明書。序列表以如下電子提交的ASCII (. txt)文本文件確定：
技術領域
[0004] 提供了具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。具體 而言，該序列提供具有肌醇六磷酸酶的高比活性、高熱穩定性、高耐熱性和多種工業用途的 肌醇六磷酸酶的增加水平的表達。
【附圖說明】
[0005] 圖1 :使用純化蛋白對肌醇六磷酸（pH 5. 5)測定比活性（U/mg)。畢赤酵母屬表達 的肌醇六磷酸酶：SEQ ID N0:8(由 SEQ ID N0:7 編碼）、SEQ ID N0:3(由 SEQ ID N0:2 編 碼）和SEQ ID N0:6(由SEQ ID N0:5編碼）與假單胞菌屬表達的肌醇六磷酸酶：SEQ ID NO:3 (由 SEQ ID NO: 1 編碼）和 SEQ ID NO:6 (由 SEQ ID N0:4 編碼）。
[0006] 圖2 :肌醇六磷酸酶SEQ ID NO: 3 (由SEQ ID NO: 1編碼）在IOOmM檸檬酸鹽pH 5. 5+10 %山梨醇-10 % NaCl中的DSC色譜圖。
[0007] 圖3 :肌醇六磷酸酶在具有和不具有10%山梨醇-10% NaCl的IOOmM檸檬酸鹽pH 5. 5 中的 DSC 1"值 CC )。SEQ ID NO:3 (由 SEQ ID NO: 1 編碼）和 SEQ ID NO:6 (由 SEQ ID N0:4編碼）是假單胞菌屬表達的。SEQ ID N0:3(由SEQ ID N0:2編碼）、SEQ ID N0:6(由 SEQ ID N0:5編碼）和SEQ ID N0:8(由SEQ ID N0:7編碼）是畢赤酵母屬表達的。
[0008] 圖4 :對4mM肌醇六磷酸鹽使用Britton-Robinson "通用"緩沖液的肌醇六磷酸 酶的 pH 曲線。SEQ ID NO:3(由 SEQ ID NO: 1 編碼）和 SEQ ID NO:6(由 SEQ ID N0:4 編 碼）是假單胞菌屬表達的。SEQ ID NO:3 (由SEQ ID NO:2編碼）和SEQ ID NO:6 (由SEQ ID N0:5編碼）是畢赤酵母屬表達的。
[0009] 圖5 :SGF+胃蛋白酶處理的肌醇六磷酸酶的SDS-PAGE。SEQ ID N0:3(由SEQ ID N0:1編碼）和SEQ ID N0:6(由SEQ ID N0:4編碼）是假單胞菌屬表達的。SEQ ID N0:3(由 SEQ ID NO:2編碼）、SEQ ID NO:6 (由 SEQ ID NO:5 編碼）和 SEQ ID NO:8 (由 SEQ ID NO:7 編碼）是畢赤酵母屬表達的。
[0010] 圖6 :熱穩定的肌醇六磷酸酶在SGF處理后的活性。觀察到熱穩定的肌醇六磷酸酶 的活性極少損失或無損失。在添加肌醇六磷酸酶之前，使用pH 11緩沖液預淬滅TO樣品。 [0011] 圖7 :肌醇六磷酸酶發酵（30L)的假單胞菌屬（P. f.)表達水平。
[0012] 圖8 :顯示當與本領域中已知的大腸桿菌肌醇六磷酸酶、修飾的大腸桿菌肌醇六 磷酸酶和真菌肌醇六磷酸酶比較時，本發明（SEQ ID N0:3)的胃穩定性。
[0013] 圖9 :顯示當與本領域中已知的大腸桿菌肌醇六磷酸酶、修飾的大腸桿菌肌醇六 磷酸酶和真菌肌醇六磷酸酶比較時，SEQ ID NO. : 3的肌醇六磷酸酶在多種濃度的肌醇六磷 酸下的肌醇六磷酸酶活性。
[0014] 圖10 :當與本領域中已知的大腸桿菌肌醇六磷酸酶、修飾的大腸桿菌肌醇六磷酸 酶和真菌肌醇六磷酸酶比較時，SEQ ID NO. : 3的肌醇六磷酸酶的DSC色譜法。
[0015] 圖11 :顯示隨時間釋放的肌醇六磷酸酶活性。
[0016] 圖12 :顯示抗營養的肌醇六磷酸酶（IP6和IP5)的水解。
[0017] 圖13 :通過HPLC顯示43天肉雞（broiler)的消化內含物（digesta content)的 肌醇磷酸酯分析。
[0018] 圖14 :顯示相對于本領域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQ ID NO. :3的肌醇六磷酸酶 的基于飼料轉化率的P當量（P equivalency)。
[0019] 圖15 :顯示相對于本領域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQ ID NO. :3的肌醇六磷酸酶 的基于腔骨灰分（tibia ash)的P當量。
[0020] 圖16 :顯示相對于本領域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQ ID NO. :3的肌醇六磷酸酶 的基于體重增加的P當量。
[0021] 描述
[0022] 肌醇六磷酸酶是催化肌醇六磷酸（肌-肌醇-六磷酸鹽 (myo-inositol-hexakisphosphate))水解為磷和肌醇的磷酸單酯水解酶。根據國際生物 化學與分子生物學聯盟（IUBMB)命名委員會和Bairoch A.，"The ENZYME database in 2000,'Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)的推薦，肌醇六磷酸酶被歸類為酶學委員 會（EC)號EC 3. 1. 3. 8,并且也被稱為：1-肌醇六磷酸酶；肌-肌醇-六磷酸鹽3-磷酸水 解酶；肌醇六磷酸鹽1-磷酸酶；肌醇六磷酸鹽3-磷酸酶；或肌醇六磷酸鹽6-磷酸酶。肌 醇六磷酸酶也被歸類為EC 3. 1. 3. 26,其也可被稱為：4_肌醇六磷酸酶；6-肌醇六磷酸酶 (基于IL-編號系統而非ID-編號命名）；或肌醇六磷酸鹽6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶還被 歸類為EC 3. 1. 3. 72,其也可被稱為5-肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶也被稱為組氨酸磷酸 酶（HAP) ;β螺旋槳肌醇六磷酸酶（β-propeller phytase);紫色酸性磷酸酶（PAP);和蛋 白酪氨酸磷酸酶（PTP)。肌醇六磷酸酶的替代名稱對本領域技術人員將是已知的。
[0023] 肌醇六磷酸酶是可具有作為動物飼料顆粒（feed pellet)中的補充物的作用的酶 的實例。肌醇六磷酸酶將肌醇六磷酸降解為肌-肌醇核心（myo-inositol core)和一個或 多個游離的磷酸鹽分子。肌醇六磷酸由共價地附連六個磷酸基團的肌-肌醇核心組成。肌 醇六磷酸是用于生成動物飼料顆粒的植物材料--比如大豆種子--的成分，所述動物比 如非反芻動物，例如家禽、肉雞、鳥、雛雞、下蛋雞（layer)、火雞、鴨、鵝和家禽（fowl);反芻 動物，例如奶牛、家牛（cattle)、馬和綿羊；家豬（pig)、豬（swine)、小豬（piglet)、生長豬 (growing pig)和母豬（sow);伴侶動物包括但不限于：貓、狗、嚙齒類動物和兔；魚類，包括 但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚；和甲殼類動物，包括但不限于河蝦（shrimp)和 對蝦。因為這些動物不能夠消化肌醇六磷酸，因此肌醇六磷酸具有許多有害作用。它螯合 二價陽離子比如鈣和鎂，并且它的磷酸鹽是飼養的動物生物上不可利用的形式，導致需要 使用這些養分補充動物飲食，盡管它們在原料中是豐富的。此外，因為這些養分未消化地通 過動物，所以它們可被進一步在食物鏈下游的能夠降解肌醇六磷酸的分解物利用，導致例 如與動物排出物接觸的地表水中的藻華。
[0024] 非反芻動物比如雛雞、家豬和魚不能從食物獲得快速生長所必需的足夠的磷，這 是因為它們不天然地產生對從在食物中發現的肌醇六磷酸釋放磷必需的肌醇六磷酸酶。因 為大部分磷以肌醇六磷酸（肌醇六磷酸鹽）的磷酸基團的形式存在，因此自基于植物的食 物和種子僅少量的磷被利用。因此，為了增加其生長，存在向動物提供磷的需要。
[0025] -種方案是向動物飼料添加無機磷補充物；然而，使用無機磷補充物導致由動物 排泄并進入環境的磷酸鹽的量增加，其導致水源的污染。
[0026] 另一種方案是向動物提供肌醇六磷酸酶補充物或向動物飼料添加肌醇六磷酸 酶。商業上可獲得的肌醇六磷酸酶產品的實例包括但不限于：PHYZYME(Dupont, Danisco, G enencor) !QUANTUM 和 FINASE(AB Vista, AB Enzymes) ;NATUPH0S(BASF) ;R0N0ZYME(DSM); Biofeed phytase(Novo Nordisk) ；Allzyme phytase(Alltech) ；0PTIPH0S(Enzyvia, Phyte x, Cornell) ;Rovabio (Adisseo) ;PHYT0UT (US Waters)。這些肌醇六磷酸酶產品中的每個至 少在生產水平、生產時間、高溫下的穩定性、低pH下的穩定性、比活性、和劑量要求上具有 限制。因此，存在將使得用戶能夠減小劑量水平并減少為動物飼料生產和提供肌醇六磷酸 酶的成本的肌醇六磷酸酶的需要，例如，可在更少時間內以較高產量產生的肌醇六磷酸酶、 在高溫下保留更多活性的肌醇六磷酸酶、在低PH下保留更多活性的肌醇六磷酸酶、或具有 較高比活性的肌醇六磷酸酶。
[0027] 肌醇六磷酸酶是由核酸序列編碼的蛋白質。將核酸序列或DNA克隆入能夠表 達或產生肌醇六磷酸酶的宿主生物。存在可用于產生蛋白質的本領域中已知的各種蛋 白表達系統。蛋白表達系統的實例包括生物比如：細菌、酵母、霉菌、哺乳動物、植物或昆 蟲。多種因素影響表達系統的選擇，比如正被表達的蛋白質的類型和產生的蛋白質產物 的量。Demain, (2009)''Production of Recombinant Protein by Microbes and higher Organisms, "Biotechnology Advances，27卷，297-306頁公開了多種蛋白表達系統的各種 優點和缺點。
[0028] 肌醇六磷酸酶商業上從各種宿主生物細胞外產生，其包括但不限于：黑曲霉、米 曲霉、繩狀青霉菌、肌醇六磷酸酶油菜（Phytase canola)(歐洲油菜（Brassica napus))、 畢赤酵母（Pichia pastoris)和栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)，參見 Pariza，"Determining the safety of enzymes used in animal feed，"Regulatory Toxicology and Pharmacology56(2010)332-342〇
[0029] 工業規模生產肌醇六磷酸酶需要在短時間量內以低成本產生高水平的酶的表達 系統。因此，存在提供滿足或超過工業規模制造肌醇六磷酸酶的生產要求的基因的需要。
[0030] 本發明的實施方式提供編碼在革蘭氏陰性菌表達系統中以高水平產生的肌醇六 磷酸酶的基因。另一個實施方式提供編碼經由細胞內表達以高水平產生的肌醇六磷酸酶 的基因。另一個實施方式在革蘭氏陰性菌表達系統中經由細胞內表達產生肌醇六磷酸 酶，其中宿主生物是假單胞菌屬。另一個實施方式在熒光假單胞菌中產生肌醇六磷酸酶。 表達系統可以是本領域中已知的任何熒光假單胞菌表達系統，例如，商業上可獲得自Dow Global Technologies Inc.的焚光假單胞菌表達系統--菌株DC454 (美國專利公開申請 號20050130160和美國專利公開申請號20050186666)。將編碼肌醇六磷酸酶或多肽的核酸 序列插入pMYC載體（Dow Global Technologies Inc.，美國專利公開申請號20050130160) 中或