通過甲酯保護的碳鏈延伸生產7碳化學物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及使用一種或多種分離的酶例如甲基轉移酶、β-酮脂酰_[acp]合酶、 β -酮硫解酶、脫氫酶、還原酶、水合酶、硫酯酶、甲酯酶、CoA-轉移酶、可逆CoA-連接酶和轉 氨酶，或使用表達一種或多種這些酶的重組宿主細胞，從丙二酰-CoA或丙二酰-[acp]以及 可選的乙酰-CoA生物合成以下一種或多種物質的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、 庚二胺（heptamethylenediamine)和1，7-庚二醇（下文稱為"C7結構單元"）。
[0002] 發明背景
[0003] 尼龍是聚酰胺，其有時通過二胺與二羧酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過 內酰胺的縮聚生成。一種無處不在的尼龍是尼龍6,6,其通過六亞甲基二胺（HMD)和 己二酸的反應生成。尼龍6通過己內酰胺的開環聚合生成（Anton&Baird, Polyamides Fibers, Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 2001)〇
[0004] 尼龍7和尼龍7, 7代表與尼龍6和尼龍6, 6相比具有增值特征的新型聚酰胺。尼 龍7是通過7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龍7, 7是通過庚二酸和庚二胺的縮聚生成的。不 存在生成用于尼龍7和尼龍7, 7的單體的經濟上可行的石油化學路徑。
[0005] 鑒于沒有經濟上可行的石油化學單體給料；生物技術提供了一種經由生物催化的 備選方法。生物催化是使用生物催化劑（諸如酶）來實施有機化合物的生物化學轉化。
[0006] 生物衍生給料和石油化學給料兩者是用于生物催化過程的可行起始材料。
[0007] 因而，針對此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-氨基庚酸、庚二胺、7-羥基 庚酸和1，7-庚二醇（h印tanediol)(下文為"C7結構單元"）的方法，其中所述方法是基于 生物催化劑的。
[0008] 然而，無野生型原核生物或真核生物天然過度生成C7結構單元或將其排出至胞 外環境。不過，已經報告了庚二酸的代謝。
[0009] 二羧酸庚二酸作為碳源經由β-氧化被眾多細菌和真菌有效轉化成中心代謝 物。輔酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的β -氧化經由例如與芳香 族底物降解有關的途徑促進進一步代謝。已經廣泛表征了 3-氧代庚二酰基-CoA被幾種 細菌分解代謝成乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA(Harwood and Parales, Annual Review of Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最優性原理陳述微生物調節其生物化學網絡以支持最大生物量生長。超出宿主 生物體中表達異源路徑的需要，將碳流量引向充當碳源而非充當生物量生長成分的C7結 構單元與最優性原理矛盾。例如，與天然生產者的產量性能相比，將1-丁醇途徑從梭菌 (Clostridium)物種轉移入其它生產菌株中經常下降一個數量級（Shen等，Appl. Environ. Microbiol. , 2011, 77(9) :2905 - 2915) 〇
[0011] 在C7脂肪族主鏈上形成末端官能團（諸如羧基、胺或羥基基團）前，7碳脂肪族主 鏈前體的有效合成是合成C7結構單元中的重要考慮因素。
[0012] 發明概述
[0013] 本申請至少部分地基于以下發現：可構建用于生產七碳鏈式脂族主鏈前體的生 物化學途徑，在所述七碳鏈式脂族主鏈前體中可形成一個或兩個官能團，例如羧基、胺或 者羥基，導致以下一種或者多種物質的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺和 1，7-庚二醇（下文稱為"C7結構單元"）。庚二酸和庚二酸鹽（酯），7-羥基庚酸和7-羥 基庚酸鹽（酯），7_氨基庚酸和7-氨基庚酸鹽（酯）本文中可替換使用，指代以其任意中 性或離子化形式的化合物，包括其任意的鹽形式。本領域的技術人員應當理解具體的形式 將依賴于pH。本文描述的這些途徑、代謝工程和培養策略依賴于脂肪酸延伸和合成酶或同 源物，其接受甲酯保護的（shielded)二羧酸作為底物。
[0014] 面對最優性原理，令人驚訝地發現，可將適當的非天然途徑、給料、宿主微生物、對 宿主的生物化學網絡的弱化策略和培養策略組合起來，從而高效地生產一種或多種C7結 構單元。
[0015] 在一些實施方案中，用于轉化為一種或多種C7結構單元的C7脂族主鏈是庚二 酰-[acp]或庚二酰-CoA (也稱為6-羧基己酰-CoA)，其可以通過兩個碳鏈延伸循環使用 NADH或NADPH依賴的酶，從丙二酰_[acp]或丙二酰-CoA以及可選的乙酰-CoA形成。見圖 1A、圖IB和圖1C。
[0016] 在一些實施方案中，末端羧基可使用庚二酰_[acp]甲酯甲基轉移酶、硫酯酶、醛 脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、可逆CoA連接酶（例如可逆琥珀酰-CoA 連接酶）或CoA-轉移酶（例如戊烯二酸CoA-轉移酶）。見圖1A、圖1B、圖IC和圖2。
[0017] 在一些實施方案中，末端胺基可以使用ω-轉氨酶或者脫乙酰基酶酶促形成。見 圖3和圖4。
[0018] 在一些實施方案中，末端羥基可以使用4-羥基丁酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶或 6-羥基己酸脫氫酶或醇脫氫酶酶促形成。見圖5和圖6。
[0019] 在一個方面，本申請的特征在于生物合成選自下組的產物的方法：庚二酸、7-氨 基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺和1，7-庚二醇。所述方法包括從（i)乙酰-CoA和丙二酰-CoA 通過兩個甲酯保護的碳鏈延伸循環或（ii)丙二酰_[acp]通過兩個甲酯保護的碳鏈延伸酶 促合成七碳鏈脂族主鏈，以及在所述主鏈中酶促形成一個或兩個選自羧基、胺和羥基的末 端官能團，從而形成所述產物。所述七碳鏈脂族主鏈可以是庚二酰_[acp]或庚二酰-CoA。 丙二酰-[acp]〇-甲基轉移酶可以將丙二酰-CoA轉化為丙二酰-CoA甲酯或可以將丙二 酰_[acp]轉化為丙二酰_[acp]甲酯。所述兩個碳鏈延伸循環的每一個可以包括使用（i) β-酮脂酰-[acp]合酶或β-酮硫解酶，（ii) 3-氧代酰基_[acp]還原酶、乙酰乙酰-CoA 還原酶、3-羥酰-CoA脫氫酶，或3-羥基丁酰-CoA脫氫酶，（iii)烯酰-CoA水合酶或3-羥 酰-[acp]脫水酶，和（iv)稀酰_[acp]還原酶或反式-2-稀酰-CoA還原酶，來從丙二 酰-[acp]甲酯生產庚二酰-[acp]甲酯，或從丙二酰-CoA甲酯生產庚二酰-CoA甲酯。庚 二酰-[acp]甲酯甲酯酶可以從庚二酰-CoA甲酯或庚二酰_[acp]甲酯移除甲基。所述丙 二酰-[acp]〇-甲基轉移酶可以與列于SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少70%的序列 同一性。所述庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶可以與列于SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少 70 %的序列同一性。
[0020] 所述兩個末端官能團可以是相同的（例如胺或羥基），或者可以是不同的（例如一 個末端胺和一個末端羧基；或一個末端羥基和一個末端羧基）。
[0021] ω-轉氨酶或者脫乙酰基酶可以酶促形成胺基。所述ω-轉氨酶可以與列于SEQ ID NO. 8-13中的任一氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0022] 6-羥基己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、或醇脫氫酶可以酶 促形成羥基基團。
[0023] 硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、CoA-轉移酶（例如戊 烯二酸CoA轉移酶）、或可逆CoA-連接酶（例如可逆琥珀酸-CoA連接酶）可以酶促形成末 端羧基基團。所述硫酯酶可以與列于SEQ ID N0:1中的氨基酸序列具有至少70%的序列同 一性。
[0024] 羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶能夠形成末端醛基，作為形成所述產物 的中間物。所述羧酸還原酶可以與列于SEQ ID NO. 2-7中的任一氨基酸序列具有至少70% 的序列同一"性。
[0025] 任意所述方法可以通過發酵在重組宿主中進行。所述宿主可以經受需氧、厭氧、微 氧或混合的氧/反硝化培養條件下的培養策略。所述宿主可以在營養限制的條件下培養。 所述宿主可以使用陶瓷中空纖維膜保留以維持發酵期間的高細胞密度。
[0026] 在任意所述方法中，所述宿主對高濃度C7結構單元的耐受可以通過在選擇環境 中連續培養來改善。
[0027] 進料至發酵的主要碳源可以衍生自生物或非生物給料。在一些實施方案中，所述 生物給料是以下物質，包括以下物質，或衍生自以下物質：單糖、二糖、木質纖維素、半纖維 素、纖維素、木質素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農業廢物、濃縮的酒糟可溶 物或城市廢物。
[0028] 在一些實施方案中，所述非生物給料是以下物質，或衍生自以下物質：天然氣、合 成氣、C0 2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、來自環己烷氧化過程的非揮發性殘留物（NVR)或者堿洗 廢物流，或對苯二甲酸/異酞酸混合物廢物流。
[0029] 本申請的特征還在于重組宿主，其包括至少一種外源性基因，所述外源性基因 編碼⑴丙二酰-[acp]〇-甲基轉移酶，（ii) β -酮脂酰_[acp]合酶或β -酮硫解酶， (iii) 3-氧代酰基_[acp]還原酶、乙酰乙酰-CoA還原酶、3-輕酰-CoA脫氫酶，或3-羥基 丁酰-CoA脫氫酶，（iv)稀酰-CoA水合酶或3-輕酰_[acp]脫水酶，（V)稀酰_[acp]還原 酶或反式-2-烯酰-CoA還原酶，以及（vi)庚二酰_[acp]甲酯甲酯酶，所述宿主生產庚二 酰-[acp]或庚二酰-CoA。
[0030] 生產庚二酰_[acp]或庚二酰-CoA的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼以 下一種或多種物質的外源性核酸：硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫 酶、戊烯二酸CoA-轉移酶、可逆琥珀酰-CoA-連接酶、乙酰化醛脫氫酶、或羧酸還原酶，所述 宿主生產庚二酸或庚二酸半醛。
[0031] 生產庚二酸半醛的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼ω-轉氨酶的外源性 核酸，并生產7-氨基庚酸。
[0032] 生產庚二酸半醛的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼以下物質的外源性核 酸：4_羥基丁酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶或6-羥基己酸脫氫酶，所述宿主生產7-羥基庚 酸。
[0033] 生產庚二酸半醛、7-氨基庚酸，或7-羥基庚酸的重組宿主進一步可以包括羧酸還 原酶、ω-轉氨酶、脫乙酰基酶、N-乙酰轉移酶、或醇脫氫酶，所述宿主生產庚二胺。
[0034] 生產7-羥基庚酸的重組宿主進一步可以包括至少一種編碼羧酸還原酶或醇脫氫 酶的外源性核酸，所述宿主生產1，7-庚二醇。
[0035] 所述重組宿主可以是原核生物，例如來自埃希氏菌屬（Escherichia)如大 腸桿菌（Escherichia coli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克魯佛梭 菌（Clostridium kluyveri);來自棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacterium glutamicum);來自貪銅菌屬（Cupriavidus)如鉤蟲貪銅菌 (Cupriavidus necator)或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metalIidurans);來自假單 胞菌屬（Pseudomonas)如焚光假單胞菌（Pseudomonas fIuorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)或者食油假單胞菌（Pseudomonas oleavorans);來自代爾夫特菌 屬（Delftia)如食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);來自芽孢桿菌屬（Bacillus) 如枯草芽胞桿菌（Bacillus subtillis);來自乳桿菌屬（Lactobacillus)如德氏乳桿 菌（Lactobacillus delbrueckii);或者來自乳球菌屬（Lactococcus)如乳酸乳球菌 (Lactococcus Iactis)或來自紅球菌屬（Rhodococcus)如馬紅球菌（Rhodococcus equi)。
[0036] 所述重組宿主可以是真核生物，例如，來自曲霉屬（Aspergi I lus)如黑曲 霉（Aspergillus niger);來自酵母屬（Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤氏酵屬（Pichia)如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);來自 耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia Iipolytica);來自伊薩 酵母屬（Issatchenkia)如東方伊薩酵母（Issathenkia orientalis);來自德巴利酵母 屬（Debaryomyces)如漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii);來自 Arxula 屬如 Arxula adenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母 菌（Kluyveromyces Iactis)的真核生物。
[0037] 本文所述的任意重組宿主進一步可以包括一種或多種以下弱化的酶：聚羥基鏈烷 酸酯合酶、乙酰-CoA硫酯酶、乙酰-CoA特異性β -酮硫解酶；形成乙酸的磷酸轉乙酰酶、 乙酸激酶、乳酸脫氫酶、甲基萘醌（menaquinol)-延胡索酸氧化還原酶、產生異丁醇的2-酮 酸脫羧酶、形成乙醇的醇脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、 消散NADH或NADPH不平衡的轉氫酶、消散NADH或NADPH不平衡的谷氨酸脫氫酶、NADH/ NADPH利用型谷氨酸脫氫酶、庚二酰-CoA脫氫酶；接受C7結構單元和中心前體作為底物的 酰基-CoA脫氫酶；戊二酰-CoA脫氫酶；或庚二酰-CoA合成酶。
[0038] 本文所述的任意重組宿主進一步可以過表達編碼以下酶的一種或多種基因：乙 酰-CoA合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；轉酮醇酶；吡啶核苷酸轉氫酶；甲酸脫氫酶；甘油 醛-3P-脫氫酶；蘋果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；果糖1，6二磷酸酶；L-丙氨酸脫氫酶； 用于產生輔助因子不平衡的NADH或NADPH特異性L-谷氨酸脫氫酶；甲醇脫氫酶、甲醛脫氫 酶、二胺轉運體、二羧酸轉運體；S-腺苷甲硫氨酸合成酶，和/或多藥物轉運體。
[0039] 本文所述途徑的反應可以在一種或多種細胞（例如宿主細胞）株中進行，所述細 胞株（a)天然表達一種或多種相關酶，（b)經遺傳工程化而表達一種或多種相關酶，或（c) 天然表達一種或多種相關酶并經遺傳工程化而表達一種或多種相關酶。或者，可以從以上 任意類型的宿主細胞中提取相關酶，并以純化或半純化形式使用。提取的酶可選地固定在 固體基質上，例如適合的反應容器的底和/或壁。此外，這些提取物包括可以作為相關酶來 源使用的裂解物（如細胞裂解物）。在本申請提供的方法中，所有步驟可以在細胞（例如宿 主細胞）中進行，所有步驟可以使用提取的酶進行，或一些步驟可以在細胞中進行，而其它 步驟可以使用提取的酶進行。
[0040] 本文所述的多種酶催化可逆反應，并且感興趣的反應可以是所述反應的逆反應。 圖1-6所示的示意性途徑闡明了對于每種中間物感興趣的反應。
[0041] 在一些實施方案中，弱化或增強所述宿主微生物的內源性生物化學網絡，來（1) 保證2-氧代戊二酸和2-氧代己二酸的細胞內可用度，（2)創造 NAD+不平衡，其僅可通過 C7結構單元的形成來平衡，（3)阻止通向并包括C7結構單元的中心代謝物、中心前體的降 解和（4)保證從細胞的高效流出。
[0042] 除非另外定義，本申請使用的所有技術和科學術語的定義與本發明所屬領域的普 通技術人員所通常理解的含義相同。雖然與本申請所述的方法和材料相似或者等同的方法 和材料也可用于實踐本發明，但在下文描述適合的方法和材料。本文提及的所有公開、專利 申請、專利和其它參考文獻通過提述完整并入本文。在沖突的情況下，以本說明書包括定義 為準。另外，材料、方法和實施例僅為示例性的而不意圖限制。
[0043] 本發明的一個或多個實施方案的細節列于下面的附圖和描述中。根據說明書和附 圖，并根據權利要求，本發明的其它特征、目的和優點將顯而易見。根據專利法的標準實踐， 詞語"包含"在權利要求中可被"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。
[0044] 附圖簡述
[0045] 圖IA是使用NADPH依賴的酶以及丙二酰_[acp]作為中心代謝物通向庚二 酰_[acp]的示例性生物化學途徑的示意圖。
[0046] 圖IB是使用NADPH依賴的酶以及乙酰-CoA和丙二酰-CoA作為中心代謝物通向 庚二酰-CoA的示例性生物化學途徑的示意圖。
[0047] 圖IC是使用NADH依賴的酶以及乙酰-CoA和丙二酰-CoA作為中心代謝物通向庚 二酰-CoA的示例性生物化學途徑的示意圖。
[0048] 圖2是使用庚二酰-[acp]、庚二酰-CoA或庚二酸半醛作為中心前體通向庚二酸的 示例性生物化學途徑的示意圖。
[0049] 圖3是使用庚二酰-CoA、庚二酸或庚二酸半醛作為中心前體通向7-氨基庚酸的示 例性生物化學途徑的示意圖。
[0050] 圖4是使用7-氨基庚酸、7-羥基庚酸或庚二酸半醛作為中心前體通向庚二胺的示 例性生物化學途徑的示意圖。
[0051] 圖5是使用庚二酸、庚二酰-CoA或庚二酸半醛作為中心前體通向7-羥基庚酸的 示例性生物化學途徑的示意圖。
[0052] 圖6是使用7-羥基庚酸作為中心前體通向1，7-庚二醇的示例性生物化學途徑的 示意圖。
[0053] 圖7含有由tesB編碼的大腸桿菌硫酯酶（參見GenBank登錄號AAA24665. 1， SEQ ID NO: 1)、海分枝桿菌（Mycobacterium marinum)駿酸還原酶（參見GenBank登錄號 ACC40567. 1，SEQ ID N0:2)、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis)駿酸還原酶（參 見 GenBank 登錄號 ABK71854. 1，SEQ ID NO: 3)、Segniliparus rugosus 駿酸還原酶（參見 GenBank登錄號EFV11917. 1，SEQ ID N0:4)、恥垢分枝桿菌羧酸還原酶（參見GenBank登錄 號 ABK75684.1，SEQ ID N0:5)、馬賽分枝桿菌（Mycobacterium massiliense)駿酸還原酶 (參見GenBank登錄號EIV11143.1，SEQ ID N0:6)、Segniliparus rotundus駿酸還原酶（參 見GenBank登錄號ADG98140.1，SEQ ID N0:7)、紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum) ω_轉氨酶（參見GenBank登錄號AAQ59697.1，SEQ ID N0:8)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ω-轉氨酶（參見 GenBank 登錄號 AAG08191. 1，SEQ ID N0:9)、丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)c〇-轉氨酶（參見GenBank登錄號AAY39893.1，SEQ ID N0:10)、球 形紅桿菌（Rhodobacter sphaeroides) ω-轉氨酶（參見 GenBank 登錄號 ABA81135. 1，SEQ ID NO: 11)、大腸桿菌ω-轉氨酶（參見GenBank登錄號AAA57874.1，SEQ ID NO: 12)、河流 弧菌（Vibrio Fluvialis) ω-轉氨酶（參見 GenBank 登錄號 AEA39183. 1，SEQ ID NO: 13)、 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)磷酸泛酰疏基乙胺基轉移酶（參見GenBank登錄號 CAA44858.1，SEQ ID NO: 14)、諾卡氏菌物種（Nocardia sp.)NRRL 5646 憐酸泛醜疏基乙胺 基轉移酶（參見GenBank登錄號ABI83656.1，SEQ ID NO: 15)、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)丙二酰-CoA甲基轉移酶（參見GenBank登錄號AAS43086. 1，SEQ ID NO: 16)或大 腸桿菌庚二酰_[acp]甲酯酯酶（參見GenBank登錄號