一種同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒三重pcr的引物組及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、 豬細小病毒三重PCR的引物組及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬圓環病毒 II 型（Porcine circovirus II，PCV2)、豬細小病毒（porcine parvovirus, PPV)、豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV)是我國集約化養 豬場普遍流行的重要病原，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。由于這三種病毒常呈混合感 染，增加了分析判斷群體感染和發病的難度。目前，常規的分析方法如病毒分離、血清學方 法等存在著耗時長、敏感度低的缺陷，已不能滿足現實生產及防病需要。
[0003] 目前，由豬圓環病毒II型、豬細小病毒以及豬偽狂犬病病毒感染引起豬免疫抑制 及繁殖障礙等病癥已經成為影響我國乃至全球養豬業的一種疾病，造成巨大經濟損失。我 國是養豬大國，研究針對三種病原混合感染的快速準確的分析方法對于養豬業健康發展具 有重要意義。傳統的病毒分離鑒定等方法耗時耗力，對于實驗條件要求比較苛刻，在一般實 驗室及基層單位較難進行，同時受采樣條件所限，分離率往往也較低，并且傳統的血清型診 斷方法有操作繁瑣復雜，耗時耗力，特異性和靈敏性低等多種不足。隨著分子生物學的發 展，PCR檢測方法能夠快速、高效的檢測出病原體。。
[0004] 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特異等優點， 自發明以來在病原的特異性檢測方面表現出明顯的優勢，多重PCR方法不僅保持了普通 PCR敏感性高和特異性強的優點，且具有一次檢測多種病原的優勢，更適于混合感染的快速 診斷。本發明針對三種病毒的保守基因設計了特異性引物，擬構建能夠同時檢測豬三種常 見病毒感染的多重PCR方法并初步應用于臨床樣品的檢測。
[0005] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體 系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的 PCR技術。可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染。所以建立檢測豬圓 環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒的三重PCR方法對于豬關節病的防治具有重要意義， 可以為其防治提供有力的技術手段。
【發明內容】
[0006] 鑒于三種病毒是當前集約化豬場的常見重要病原體，且往往與多種病毒和細菌混 合感染，引起豬免疫抑制及繁殖障礙等疾病，傳統的分析鑒定技術費時費力，不適于臨床快 速檢驗分析，也不適于大規模的流行病學調查的現狀，本發明目的在于克服現有技術的不 足，提供一種同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒三重PCR的引物組及其應 用。
[0007] 本發明針對實際生產中豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒混合感染，且 臨床很難區分的情況，本著從樣品中同時分析鑒定三種病原體的目標，從已發表的文獻中 篩選出具有病原體致病性特點的保護性片段的編碼基因片段，作為PCR檢測的三個基因靶 點，得到同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒三重PCR的引物組。同時本發 明將擴增這3個基因片段的引物組放在一個PCR反應體系，通過對退火溫度、特異性等各項 參數調整優化，建立了可直接從樣品中鑒定分析三種病原體的三重PCR方法。
[0008] 豬圓環病毒2型（PCV2)的0RF2編碼病毒的Cap蛋白，血清學實驗顯示，對于無致 病性的PCVl與致病性的PCV2,兩者的R印蛋白會產生抗原交叉性，而Cap蛋白不產生交叉 反應，因此選擇0RF2編碼的結構蛋白作為檢測目的片段；豬偽狂犬病毒（PRV)的gB(g II ) 是PRV所有糖蛋白中最保守的，是病毒的一個重要包膜組分和中和抗原，是病毒感染宿主 細胞必不可少的成份；而豬細小病毒（PPV)的VP2蛋白是構成PPV病毒粒子的主要保護性 抗原，具有血凝活性和良好的免疫原性，可以誘導機體產生強烈的免疫反應。因此，與傳統 PCR不同，本發明選擇上述三個基因片段作為三重PCR的靶標分子，這樣一方面可及時驗證 目標病原體在樣品中的存在，更重要的是可對所擴增的病毒保護性片段進行序列分析，實 時監測病原主要保護性蛋白的變異，為及時掌握病毒致病性特點及其變異趨勢和規律、選 擇合適的疫苗提供科學依據。
[0009] 本發明是通過以下的技術方案實現的。
[0010] 本發明提供一種同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、豬細小病毒三重PCR的引 物組，擴增豬圓環病毒2型的上游引物序列如SEQ ID NO: 1所示，擴增豬圓環病毒2型的下 游引物序列如SEQ ID N0:2所示；擴增偽狂犬病毒的上游引物序列如SEQ ID N0:3所示，擴 增偽狂犬病毒的上游引物序列如SEQ ID N0:4所示；擴增豬細小病毒的上游引物如SEQ ID NO:5所示，擴增豬細小病毒的上游引物序列如SEQ ID NO:6所示。（見表1)
[0011] 表1多重PCR引物組
[0014] 本發明進一步提供上述三重PCR的引物組在制備同時檢測豬圓環病毒2型、偽狂 犬病毒、豬細小病毒試劑中的應用。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明篩選具有豬圓環病毒2型 (PCV2)特點的0RF2編碼基因、豬偽狂犬病毒（PRV)的gB(g II )編碼基因以及豬細小病毒 (PPV)的VP2蛋白的編碼基因，作為PCR檢測的三個基因靶點，得到檢測豬圓環病毒2型、偽 狂犬病毒、豬細小病毒三重PCR的引物組；同時本發明在退火溫度及其他反應體系參數等 方面進行探索，確定靈敏度高、特異性強的多重PCR檢測體系，建立直接從樣品中檢測三種 病原體的三重PCR檢測方法，實驗證明，較現有報道的PCR檢測方法，利用本發明的引物組 的多重PCR檢測方法特異性強、靈敏度高，檢測效率高。
[0016] 與傳統PCR逐一擴增單一病原體不同，本發明針對病原體三個基因靶點，這樣一 方面可及時驗證目標病原體在樣品中的存在，更重要的是可對所擴增的病毒保護性片段進 行序列分析，實時監測病原主要保護性蛋白的變異，為及時掌握病毒致病性特點及其變異 趨勢和規律、選擇合適的疫苗提供科學依據。
【附圖說明】
[0017] 圖1為多重PCR退火溫度的確定圖示；(M :DNA2000Marker ;1為陰性對照；2~6 退火溫度分別為 52 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C )。
[0018] 圖2為多重PCR特異性測定結果圖示；(M :DNA2000Marker ;1~9模板分別為PPV、 PCV2、PRV、PPV+PCV2+PRV、PRRSV、Ε· coli、PDEV、TGEV、（IdH2O)。
[0019] 圖3為多重PCR敏感性測定結果圖示；(M :DNA2000Marker ;1為陰性對照；2~ 9. 10°~10 7倍比稀釋的質粒多重PCR結果）。
【具體實施方式】
[0020] 本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過 程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件。
[0021] 實施例1擴增豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒保護性片段三重PCR 體系退火溫度的確定
[0022] 對于PCR反應體系，特別是多重PCR反應體系中，退火溫度是一個關鍵的因素。本 發明為了摸索三重PCR體系中適合3對引物的退火溫度，特設計三重PCR反應體系進行最 佳退火溫度確定。
[0023] 1樣品前處理
[0024] 取約2g豬扁桃體組織樣品于2ml EP管中，并加入1ml Buffer A，利用全自動組 織研磨機進行研磨。取上述研磨液上清250 μ 1至無菌EP管，加10 μ I OB Protease和 250 μ IBuffer BL。再加入4 μ I Linear Acrylamide (每250 μ I Buffer BL)劇烈振蕩 15s〇 65°C孵育lOmin，中間短暫震蕩1次，加260 μ 1無水酒精，劇烈振蕩20s混合均勻，短暫離心 以將蓋子上液體全部收集。
[0025] 2病毒DNA的提取
[0026] 將柱子置入新2mlEP管，并用500 μ I Buffer HB洗脫，8000g，lmin，棄去液體，保 留離心管。將柱子放回2mlEP管，并用700 μ I DNA wash Buffer (已加8ml酒精稀釋）洗 脫，8000g，Imin離心，棄去離心管及液體。柱子置回EP管，13300g，2min離心，使柱子離干。 (此步對于保證下面理想的洗脫非常重要。）將柱子置于1.5ml EP管，并加50~100 μ 1 Elution Buffer (預熱至65°C)，室溫下靜置5min。8000g，Imin離心以將DNA從柱子上 洗脫，保存離心下的液體（含DNA)。將柱子置入第二個I. 5mlEP管，再次加50~100 μ I Elution Buffer，