一種檢測小反芻獸疫病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測小反芻獸疫病毒（PPRV)的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0003] 小反會獸疫（pestedes petits ruminants, PPR)，是由小反會獸疫病毒（PPRV) 引起的一種急性、烈性、接觸性傳染病，主要感染山羊、綿羊等小反芻獸，特別是山羊高度易 感，野生動物偶然發生，感染率和死亡率高達100%和90%。OIE曾將該病例為發病必須報告 的A類動物傳染病，我國將其列為I類動物疫病，一旦發現必須采取緊急嚴厲的措施進行 控制和撲滅。在我國周邊的老撾、孟加拉國、印度、尼泊爾、俄羅斯、巴基斯坦和緬甸等國家 大規模暴發疫情，對我國養羊業構成了嚴重威脅。2007年7月，我國西藏日土縣發生PPR疫 情，雖然及時采取有效措施撲滅了這次疫情，但這些年我國的一些省份都有小反芻獸疫陽 性病例的報道，這提醒我們要對該疾病持續監測，防止疫情再次出現。因此，建立特異、敏感 的PPR診斷技術非常重要。
[0004] 目前，小反芻獸疫病毒的檢測技術主要病毒分離鑒定、抗體血清學檢測、病毒核酸 檢測。病毒分離鑒定方法，其結果準確可靠，但該方法操作復雜，需要復雜的儀器設備和安 全級別高的實驗室環境，對操作人員的技術水平要求高，此外所需時間長，以及受影響的因 素多等缺點，不利小反芻獸疫病毒的快速診斷。抗體血清學檢測技術主要是采用OIE推薦 的病毒中和試驗（VNT)和競爭ELISA(c-ELISA )。由于小反芻獸疫病毒和同屬的牛瘟病毒， 在血清檢測中具有共同的抗原，中和試驗也有一定程度的交叉反應，因此二者極易混淆；競 爭ELISA也費時且要求活病毒存在。病毒核酸檢測方法主要普通的RT-PCR方法和熒光 RT-PCR方法，后者的檢測敏感性比前者高，雖然這兩種方法較病毒分離鑒定和血清學檢測 方法快速準確，RT-PCR需要昂貴的PCR儀，且在結果判定上需要進行瓊脂糖凝膠電泳，容 易造成實驗室污染導致出現假陽性結果，盡管熒光RT-PCR在結果判定上可直接在儀器上 讀取結果，但是熒光PCR儀比普通PCR儀更昂貴，且試劑費更高，不利于基層檢測以及現場 批量檢測。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了解決基層快速、批量、準確檢測小反芻獸疫（PPRV)，提供一 種方便基層簡便、快捷準確地檢測PPRV的試劑盒。為實現本發明目的所使用的技術方案 為：一種檢測小反芻獸疫病毒的轉錄環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、 2X反應緩沖液、酶混合物EM、熒光目視檢測試劑、超純水、陽性對照和陰性對照，所述的 RT-LAMP 引物包括外引物 F3 (SEQ ID N0:1)與 B3 (SEQ ID N0:2)、內引物 FIP (SEQ ID NO :3)與 BIP (SEQ ID NO :4)和環引物 LF (SEQ ID NO :5)與 LB (SEQ ID NO :6); 其中引物的序列分別為： F3 GACCAGAGAAGGGGTCAAAG B3 CTGCAGCCTGAAGAGTGC FIP TCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG BIP GCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT LF GTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC LB AGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT ； 以上所述的 2X 反應緩沖液包括 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
[0006] 以上所述的反應模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取小反芻獸疫病 毒的RNA，或者疑似小反芻獸疫病毒感染的組織的RNA。
[0007] 以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0008] 以上所述的 2X 反應緩沖液包括 Tris-HCL 40-50mM、KCL 20-30mM、MgSO4 16-20mM、（NH4)2SO4 20-25mM、Tween20 0· 2-0. 5 %、Betaine I. 6-3. 2M 和 dNTPs 2· 8-4 mM， 其配制方法在pH為8. 8條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0009] -種檢測小反芻獸疫病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，主要用于檢測 獸醫臨床上疑似PPRV感染的病變組織是否存在PPRV，具體檢測步驟包括： (1) 模板RNA模板的提取 (2) RT-LAMP 檢測。
[0010] 所述的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒反應體系建立以25 μ L計， 2X反應緩沖液 12. 5 yL 酶混合物EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 模板 5 μ L 超純水 補足25 μ L。
[0011] 以上所述的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒檢測過程采用實時濁度儀LA-320C進 行密閉全程監控，反應程序為63°C反應60分鐘，80°C滅活5分鐘。
[0012] 本發明的實質性特點和顯著的進步是： 1)特異性強 本發明的RT-LAMP檢測試劑盒特異性檢測出小反芻獸疫（PPRV)，所檢測的陰性對照病 毒和水對照均無陽性結果出來，與RT-PCR檢測結果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結果、 無需昂貴復雜的儀器，對操作人員的技術水平要求較低。
[0013] 2)靈敏度高 普通的RT-PCR檢測方法的靈敏度為9. 8 X 10 3 ng/ μ L，而使用本發明的RT-LAMP檢測 方法，檢測限約為9. 8 X 10 4 ng/ μ L，是普通RT-PCR的10倍。
[0014] 3)耗時少 普通RT-PCR法需先進行反轉錄（RT)，然后再以RT產物為模板進行PCR反應，使用了兩 個反應程序，擴增結束后得通過凝膠電泳的方法進行結果判定，整個過程在24小時左右才 能得出結果；而本發明的RT-LAMP方法可在一個反應管內同時完成兩個反應程序，在20-30 分鐘間出現擴增，一個小時內即可完成擴增，從病毒RNA提取到獲得最終結果可在2-3小時 內完成，特別是在于批量檢測，優勢更明顯。
[0015] 4)結果判讀簡便 本發明的RT-LAMP方法在擴增結束即可判讀結果，在可見光下將陽、陰性管進行比較， 通過肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性反應管透明；短暫離心后，陽性反應管底部 有明顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽性反應管 在紫外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實驗結果。不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析 顯像或者開蓋加入熒光染料進行來判讀結果。
[0016] 5)不造成污染 目前雖然已經建立有RT-LAMP顯色法用于檢測小反芻獸疫病毒，但顯色法只能是反應 結束后開蓋加入熒光染料進行顯色反應，觀察是否有顯色來判讀試驗結果，或者通過跑電 泳的方法進行結果判定，開蓋檢測容易造成氣溶膠產物污染實驗室。而本發明的RT-LAMP 熒光目視檢測方法，熒光染料是在反應前加入，避免開蓋造成污染。此外，本發明的RT-LAMP 檢測方法在結果判定上，直接通過濁度儀檢測反應管的濁度值來判定結果，可不進行熒光 染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，不需要開蓋，能有效避免污染。
[0017] 5)可實時定量 本發明利用LA-320C濁度儀來實時分析RT-LAMP反應的結果，不同的標準樣品的濃度 對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的小反芻獸 疫病毒拷貝數，達到定量檢測產物的目的。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明RT-LAMP檢測方法特異性檢測結果；其中：1 :小反芻獸疫病毒；2 : 口 蹄疫病毒；3 :藍舌病病毒；4 :犬痕熱病毒；5 :牛病毒性腹瀉病毒；6 :牛冠狀病毒；7 :細小 病毒；8 :傳染性胃腸炎病毒；9 :水對照。特異性檢測結果顯示，只有小反芻獸疫病毒反應管 出現濁度的上升曲線，7株對照病毒反應管和水對照反應管均無擴增。
[0019] 圖2和圖3是本發明RT-LAMP檢測及普通RT-PCR檢測的敏感性檢測結果；其 中 I :9. 8X 100ng/ yL ;2 :9. 8X 10 1 ng/ yL ;3 :9. 8X 10 2ng/ yL ;4 :9. 8X 10 3ng/ μ L ; 5 :9. 8Χ 10 4ng/ μ L ;6 :9. 8Χ 10 5ng/ μ L ;7 :9. 8Χ 10 6ng/ μ L ;8 :9. 8Χ 10 7ng/ μ L ;9 : 9.8Χ108 ng/yL ;10 :water。PPRV 原始 RNA 的起始濃度為 9.8X10°ng/yL，經 10 倍倍比 連續稀釋后，進行RT-LAMP和RT-PCR擴增，結果顯示RT-LAMP法檢測限約為9. 8 X 10 4ng/ μ L，而 RT-PCR 法檢測限為 9. 8 X 10 3ng/ μ L。
[0020] 圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結果：左管為PPRV RNA為模板的反應情況，為陽 性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。
[0021] 圖5是本發明定量檢測PPRV的標準曲線；利用不同的標準樣品的濃度對