Il28b基因位點多態性多通道熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及基于多通道熒光PCR法對IL28B基因位點多 態性檢測的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎是一種世界范圍內廣泛流行的傳染性疾病，據統計，全球目前有約1.8 億人曾感染過HCV病毒，約占人口總數的3%。丙型肝炎的傳播方式主要為血液傳播，此外 針刺、吸毒等也是其常見的感染途徑。目前諸多研究表明，丙型肝炎預后轉歸、接受抗病毒 治療的療效與宿主IL28B基因多態性密切相關。
[0003] IL28B基因位于19號染色體上，由6個外顯子和5個內含子組成，其編碼產物 IFN-λ 3屬于III型干擾素家族，參與抗病毒治療的應答反應，從而影響HCV感染者自發清 除病毒及接受干擾素治療后的應答能力。在對不同人種丙型肝炎患者進行基因檢測后發 現：IL28B基因單核苷酸多態性位點rsl2979860和rs8099917與持續病毒學應答顯著相 關。
[0004] 文獻指出，rsl2979860是目前已知與HCV感染治療后持續病毒性應答率 (sustained viral response, SVR)最為相關的指標，在接受標準治療方案治療過程中，攜 帶C/C基因型的患者可獲得更高的SVR，約是其它基因型的2~3倍，且C/C型比例越高，慢 性丙型肝炎患者的病毒自發清除率越高。rs8099917位點基因型為T/T，T/G，G/G三種，其 中T/T為保護性基因型，攜帶T/T基因型的患者比T/G和G/G型可以獲得更好的抗病毒效 果。因此，檢測rsl2979860和rs8099917位點多態性可以為臨床提供參考，對患者的治療 起重要的作用。
[0005] 目前臨床上檢測IL28B基因多態性的方法有很多，包括溶解曲線法、ARMS-PCR法、 測序法等。溶解曲線法對儀器的溫控性要求很高，要求儀器具有高分辨率溶解曲線分析 (HRM)功能，而我們常用的熒光定量PCR儀一般缺少此功能；ARMS-PCR法需要對PCR產物進 行電泳分析，不適于臨床應用；測序法準確性高，但是儀器昂貴，操作較復雜耗時長，對操作 者和實驗場地要求較高。
[0006] 中國專利《基于實時熒光PCR的IL28B基因多態性檢測試劑盒》申請號為 201510007333. 1公開了一種基于實時熒光PCR的IL28B基因多態性檢測試劑盒，兩個多態 性位點分別有一管反應液，即每個樣本需要兩管反應液檢測，第一個缺點是每個樣本需要 占用兩個反應孔從而使通量減半。第二個缺點是操作不便，若首先檢測其中一個位點，則需 嚴格按照樣本原順序檢測另一位點，一旦出現樣本遺漏或順序錯亂，則給結果判讀造成很 大麻煩；若按照每個樣本同時檢測兩個位點操作，則在加反應液時要嚴格記錄不同反應液 的加樣順序，避免結果誤判。另外，從其專利公布的附圖可以看出，其純合子的擴增曲線圖 存在明顯的非特異性擴增，很容易判讀為雜合子，這與引物探針的設計及探針發光基團和 淬滅基團的選擇存在較大關系，對于沒有判讀經驗的操作人員來說很難準確判讀結果。
[0007] 因此，提供一種效率高、成本低、適于臨床檢測的試劑盒是目前亟待解決的技術難 題。
【發明內容】
[0008] 針對上述現有技術存在的不足，本發明提供一種IL28B基因位點多態性多通道熒 光PCR檢測試劑盒以及IL28B基因位點多態性檢測的引物和探針，該試劑盒可以專一地檢 測IL28B基因 rsl2979860和rs8099917位點多態性，一個PCR反應管內對這兩個位點同時 進行檢測，明確具體基因型，且操作簡便快捷，結果客觀可控性強，效率高、成本低，閉管操 作防污染，適用多通道熒光PCR儀，是臨床上進行IL28B基因位點多態性檢測的強有力產 品。
[0009] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0010] 一種IL28B基因位點多態性檢測的引物和熒光探針，以rsl2979860和rs8099917 位點為檢測對象，設計特異性引物和探針，所述特異性引物包括用于擴增rsl2979860的引 物1，其序列如列表中SEQ ID:1和SEQ ID:2所示；用于擴增rs8099917的引物2,其序列如 列表中SEQ ID:3和SEQ ID:4所示；所述探針包括用于特異性檢測rsl2979860的C/T基因 型的探針IC和1T，其序列如列表中SEQ ID:5和SEQ ID:6所示；所述探針包括用于特異性 檢測rs8099917的T/G基因型的探針2T和2G，其序列如列表中SEQ ID:7和SEQ ID:8所 示；所述探針還分別連接有熒光發光基團和熒光淬滅基團，其中，探針1C、探針1T、探針2T、 探針2G的熒光發光基團分別為FAM、VIC、ROX、TAMRA;各探針的熒光淬滅基團均為E ClipSe。
[0011] 所述引物探針序列如下：
[0012] 引物 IF :5'-CTGGGATTCCTGGACGTGGATGGG-3' (SEQ ID:1)
[0013] 引物 IR :5'-CGCAGGCTCAGGGTCAATCACAG-3' (SEQ ID:2)
[0014] 引物 2F :5,-CAATTTGTCACTGTTCCTCCT-3， (SEQ ID:3)
[0015] 引物 2R :5,-GCTCTTGTCATTTGCCTTTACT-3' (SEQ ID:4)
[0016] 探針 IC :5,-TCAACCCTGGTTCGCGCCTTCGG-3' (SEQ ID:5)
[0017] 探針 IT :5'-TCAACCCTGGTTCACGCCTTCG-3' (SEQ ID:6)
[0018] 探針 2T :5,-ATTTGGGTGAAATTGCTCACAG-3' (SEQ ID:7)
[0019] 探針 2G :5'-ATTTGGGTGACATTGCTCACAG-3' (SEQ ID:8)
[0020] 所述引物和熒光探針在檢測IL28rsl2979860和IL28rs8099917基因型的應用，并 且在制備檢測IL28B基因位點多態性多通道熒光PCR檢測試劑盒的應用。
[0021] -種IL28B基因位點多態性多通道熒光PCR檢測試劑盒，包含所述的引物和熒光 探針。
[0022] 所述試劑盒還包括陰性質控和陽性質控，陰性質控為連入T載體的rsl2979860的 C/C基因型和rs8099917的T/T基因型的部分序列，其序列如序列表中SEQ ID:9所示；陽 性質控為連入T載體的rsl2979860的T/T基因型和rs8099917的G/G基因型的部分序列， 其序列如序列表中SEQ ID: 10所示。
[0023] 具體的，一種IL28B基因位點多態性多通道熒光PCR檢測試劑盒，由DNA提取液、 PCR反應液、陰性質控和陽性質控組成，其中，PCR反應液包括：10 XPCR緩沖液5. 0 μ 1、 MgCl22. 0 ~5. OmM、dNTPs 0· 5 ~I. 5mM、引物 0· 2 ~2. 0 μ Μ、探針 0· 1 ~I. 0 μ M、Taq 酶 2. 0~4. 0U、UNG酶0. 5~I. 0U，加水至25 μ 1。所述引物為引物1、引物2 ;所述探針為探 針1和探針2。
[0024] 所述的試劑盒在檢測IL28rsl2979860和IL28rs8099917基因型的應用；
[0025] 采用該IL28B基因位點多態性多通道熒光PCR檢測試劑盒進行檢測的方法，包括 以下步驟：
[0026] 分裝PCR反應液于PCR反應管內；分別加入待測DNA模板、陰性對照和陽性對照， 混勻后置于熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應，每個循環在設定溫度下采集熒光；根據擴 增曲線的信號情況判讀基因型。
[0027] 具體的步驟如下：
[0028] 分裝23 μ L反應液于PCR反應管內，分裝管數=n+2 (注：η為待測樣本數，2為用于 陰性對照、陽性對照的管數）；分別加入2 μ L待測DNA模板、陰性、陽性對照，混勻后置于熒 光定量PCR儀上進行PCR擴增反應；反應程序為50°C 2min ;94°C 3min ;94°C 25s，61°C 40s， 4〇個循環，每個循環在ere采集熒光；根據擴增曲線的信號情況判讀基因型。
[0029] 首先陰性質控只有FAM、ROX擴增曲線，陽性質控只有VIC、TAMRA擴增曲線，則檢測 結果符合預期結果，可以對樣本進行分析。
[0030] 每個樣本至少會有兩條曲線生成，首先分析代表rsl2979860位點的FAM、VIC曲 線：若只有FAM曲線，表明樣本為C/C型；若只有VIC曲線，表明樣本為T/T型；若同時有FAM 和VIC曲線，表明樣本為C/T型。
[0031] 然后分析代表rs8099917位點的R0X、TAMRA曲線：若只有ROX曲線，表明樣本為T/ T型；若只有TAMRA曲線，表明樣本為G/G型；若同時有ROX和TAMRA曲線，表明樣本為T/G 型。
[0032] 所述的方法在檢測IL28rsl2979860和IL28rs8099917基因型的應用。
[0033] 本發明的有益效果是：
[0034] (1)本發明使用熒光PCR法檢測IL28B基因位點多態性，操作簡單快速、結果準確、 靈敏度高、閉管操作避免交叉污染，有利于IL28B基因位點多態性檢測的推廣。
[0035] (2)本