一種細胞可回復性永生化的多順反子載體及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種細胞可回復性永生化的多順反子載 體及其構建方法。本發明涉及基因間共表達調控序列、DNA重組和質粒轉化等基因工程學， 以及通過基因工程學方法重組多基因共表達質粒及其用途，包括一種含有Cre-er融合基 因序列、SV40LT基因序列、hTERT基因序列、NeoR基因序列、EGFP-TK融合基因序列以及人 工設計并合成含有四個FMDV-2A自剪肽的多克隆位點序列的質粒型逆轉錄病毒載體和該 質粒型逆轉錄病毒載體的構建方法。
【背景技術】
[0002] 研究一種物質或某個基因是否參與了脂肪組織的成脂定型、成脂分化或脂質代謝 的調節作用，至少要觀察前脂肪細胞或脂肪細胞是否對該處理因素有響應。關于豬脂肪發 育、脂肪沉積，尤其是肌內脂肪的沉積，到目前為止還沒有系統的研究，這主要是由于缺少 來源于豬脂肪組織合適的脂肪細胞系，它們需具有來源于健康活體的正常脂肪細胞且能夠 在體外長期培養以便于進行實驗。然而，利用現有方法分離的原代細胞壽命有限，往往僅能 有限的傳代幾次便進入衰老狀態，此外，每次獲取原代細胞用于實驗的過程不僅費時費力， 還受到科研資金和動物福利的限制。同時，由于豬的個體差異、取樣分離細胞技術的差異和 細胞衰老狀態的差異等等諸如此類的差異使得這方面的研究不能廣泛的推廣。上述的限制 因素均使得大規模的研究豬脂肪沉積機理的進程受到了阻礙。本發明，一種細胞可回復性 永生化的多順反子載體及其構建方法為上述問題帶來了轉機。
[0003] 國外文獻報道，猿猴病毒大T抗原基因（SV40LT)和人端粒酶基因（hTERT)不僅可 以加快細胞的生長速率，增加細胞的傳代次數，也可以使細胞轉化為永生化細胞系。然而， SV40LT處理的細胞雖然度過了衰老期（Μ I期），但多數細胞最終會進入危機期（Μ II期） 而死亡。此時，細胞染色體異常，細胞的分裂逐漸減少，細胞死亡率增加。同時，SV40病毒 也具有致瘤性，而hTERT處理的細胞基本能保持染色體穩定、分化正常和無致瘤性等特點， hTERT可以維持細胞染色體端粒的穩定，使細胞度過M II期，從而繼續存活。因此，本發明， 一種細胞可回復性永生化的多順反子載體將SV40LT和hTERT用FMDV-2a自剪肽串聯表達， 不僅避免了共轉兩個質粒時表達效率的偏差，也使得最終獲得的細胞既能夠度過M I期， 又能夠度過M II期，為真正獲得壽命更長、更穩定的細胞系提供了一個可實現的基礎、路徑 和技術支持。
[0004] 通常情況下，永生化細胞系是利用重組病毒或逆轉錄病毒進行制備，用此類方法 產生的永生化細胞系雖說可增加原代細胞體外擴增的能力，但轉化的細胞有時會在細胞的 表型及功能上可能和所來源的原代細胞有所差別，甚至表現出不同的代謝方式，原有的分 化特性退化等問題。因此，將病毒轉化的細胞系替代原代細胞的作為模式模型細胞進行研 究存在潛在的風險性。為了解決這一問題，同時為了生物安全性的考量，我們在所構建的質 粒型逆轉錄病毒載體中引入了 Cre-LoxP重組酶系統，構建了一種用于細胞可回復性永生 化的多順反子載體。
[0005] Cre重組酶在1981年從Pl噬菌體中發現，它具有能識別特異的DNA序列的特性， 即識別LoxP位點，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。借助Cre-LoxP重組酶技術我 們構建了含永生化基因 SV40LT和hTERT的可回復性永生化的多順反子載體，該多順反子載 體可以用于原代細胞的轉染，使原代細胞發生永生化，便于細胞的大量增殖、傳代及保存， 并且在實驗過程中，當需要將細胞用于正常生理或遺傳實驗時，可以利用位點特異性重組 酶Cre識別特異性位點LoxP，切除位于兩個同向LoxP序列之間的外源基因，使細胞回復到 永生化之前的狀態。在解決了原代細胞體外增殖傳代問題的同時，又克服了永生化細胞惡 性轉變，細胞安全性差和表型功能偏差的難題。
[0006] 鑒于Cre-LoxP重組酶系統重組效率的問題，為最終獲得純粹的回復細胞，我們引 入了自殺基因清除未發生重組的細胞。胸苷激酶（TK)對更昔洛韋敏感，當在培養基中添加 更昔洛韋時可清除少數未發生Cre-LoxP重組的未回復細胞，而回復的細胞由于TK基因被 切除使得其對更昔洛韋耐藥而不受影響，從而獲得完全的回復細胞。
[0007] 在本發明的載體中，需要實現Cre-er、SV40LT、hTERT、NeoR和EGFP-TK五個基因 共表達，如果利用傳統方法，在五個基因之間同時引入四個"內部核糖體引入位點"（IRES)， 不僅大大增加了載體序列的長度，而且由于IRES自身的特性，極有可能導致后三個基因的 表達量偏低，進而影響永生化細胞的建立。因此，本發明一種細胞可回復性永生化的多順反 子載體在各個基因間引入了口蹄疫病毒自剪肽（FMDV-2A)，設計并人工合成了一個包含四 個口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位點（MCS)--4XFMDV-2A-MCS。考慮到在同一載體中引入 多個相同的序列，存在發生同源重組的可能性，因此在設計4個FMDV-2A自剪肽序列時，我 們利用同義突變原理使得4個FMDV-2A自剪肽的核苷酸序列不一樣，但均能編碼相同的功 能蛋白。該自剪肽在翻譯水平2A的C端甘氨酸與2B的N端的脯氨酸自我剪切，自剪切后 上游的氨基酸殘基和上游蛋白融合，下游的脯氨酸殘基和下游蛋白融合。目前，該自剪肽已 被廣泛的應用于構建多基因共表達的載體。除了序列短的優點外，其介導的多基因的表達 效率也比IRES序列高，本發明引入自剪肽序列可以盡可能確保質粒中五個基因的表達，與 此同時，在Cre發揮重組酶活性時，編碼自剪肽的序列也會隨多順反子一并切除，因此不必 擔心該序列殘留帶來未知的作用。
[0008] 豬前體脂肪細胞和肌內脂肪細胞已成為限制研究豬脂肪沉積和肌內脂肪發育機 制的瓶頸問題，解決這一問題將大大提升該領域的研究空間并節省該領域的研究時間。目 前市場上尚無豬源脂肪細胞系的相關報道。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種細胞可回復性永生化的多順 反子載體及其構建方法，即利用基于Cre-LoxP系統介導的能夠同時表達永生化基因及篩 選標記基因的重組逆轉錄病毒載體，為改造細胞的傳代能力以及為原代細胞系材料的擴大 化奠定了基礎。以期為豬永生化細胞系的構建提供一種新方法和路徑。
[0010] 具體地，本發明的目的之一是提供一種同時含有融合雌激素受體的重組酶基 因（Cre-er)、猿猴病毒大T抗原基因（SV40LT)、人端粒酶基因（hTERT)、新霉素耐藥基因 (NeoR)和融合胸苷激酶的增強綠色熒光蛋白基因（EGFP-TK)的多順反子共表達質粒。 [0011] 本發明的目的之二是提供上述表達質粒的構建方法。
[0012] 本發明的目的之三是提供上述共表達質粒的用途。
[0013] 本發明的多順反子共表達質粒是一種包含融合雌激素受體的重組酶基因 (Cre-er)、猿猴病毒大T抗原基因（SV40LT)、人端粒酶基因（hTERT)、新霉素耐藥基因 (NeoR)和融合胸苷激酶的增強綠色熒光蛋白基因（EGFP-TK)的質粒，其結構如圖13所示。
[0014] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0015] -種質粒型逆轉錄病毒載體pCSHNET，該載體包含有以下五個如序列表SEQ ID NO : 1-5所示核苷酸序列的多順反子基因以及一個逆轉錄病毒系統；
[0016] SEQ ID NO : 1所示核苷酸序列的融合雌激素受體的重組酶Cre-er基因；
[0017] SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的猿猴病毒大T抗原SV40LT基因；
[0018] SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的人端粒酶hTERT基因；
[0019] SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的新霉素耐藥NeoR基因；和
[0020] SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的融合胸苷激酶的增強綠色熒光蛋白EGFP-TK基 因；
[0021] 其中：所述的逆轉錄病毒系統為一種口蹄疫病毒自剪肽FMDV-2A的短肽，其核苷 酸序列如SEQ ID NO :6-9所示。
[0022] 所述的質粒型逆轉錄病毒載體pCSHNET的五個插入基因由四個自剪肽連接而成， 這四個自剪肽的核苷酸序列不同，但編碼蛋白的氨基酸序列是相同的。
[0023] 連接4個自剪肽的多克隆酶切位點如圖16所示，依次為：Nhe I、Mss I、Asc I、Smi I、Mre I、Eco72I、MauB I、Sal I和Bstl 1071，所述的酶切位點的順序按平末端與粘性末端 酶切位點交替排列，保證插入基因的方向與基因表達的方向相一致。
[0024] 如圖13所示的質粒型逆轉錄病毒載體pCSHNET的第二個Moloney鼠白血病病毒 長末端重復序列MoMuLV_LTR內包含一個噬菌體Pl重組位點LoxP，所述LoxP的核苷酸序列 如 SEQ ID NO : 10 所示。
[0025] 申請人提供了一種質粒型逆轉錄病毒載體pCSHNET的構建方法，包括下列步驟：
[0026] (1)將如圖2所示的起始質粒pCTGTKlox的第二個Cla I酶切位點利用定點突變 方法突變成Bstll07 I酶切位點獲得中間質粒pCB ;
[0027] (2)人工合成含有四個口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位點序列，每個自剪肽的核苷 酸序列如SEQ ID NO :6-9所示；
[0028] (3)用含酶切位點的引物分別擴增Cre-er基因和hTERT基因片段，使Cre-er基因 序列的5'端含有EcoR I酶切位點，3'端依次含有Nhe I和Bstll07 I酶切位點，使hTERT 基因的5'端含有Smi I酶切位點，3'端含有Mre I酶切位點；
[0029] (4)將步驟⑴中獲得的中間質粒pCB和步驟（3)中Cre-er擴增片段分別用限制 性內切酶EcoR I和Bstll07 I雙酶切，將酶切后的骨架質粒片段和Cre-er融合基因片段 用T4DNA Ligase進行連接反應，將所得的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細菌，得到 中間質粒pCB-Cre-er ;
[0030] (5)將步驟（4)中獲