用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構建方法
【技術領域】
[0001] 本申請涉及一種用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構建方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。目前的診治 手段由于缺乏膀胱癌高特異性靶點等原因，不能有效地通過單靶點區分正常細胞和膀胱癌 細胞，急需研發對膀胱癌更加特異的精準治療方法。膀胱癌系統生物學和基因組學的研究， 使人們有可能對腫瘤細胞基因突變以及潛在的治療靶點有比較全面的認識和了解。
【發明內容】
[0003] 本發明提供一種新的用于檢測膀胱癌的試劑盒。
[0004] 本發明提供一種用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構建方法，包括：
[0005] a)用PCR方法擴增序列：如SEQ ID NO: 1所示的hUPII啟動子序列，如SEQ ID NO: 2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQ ID NO: 3所示的hTERT啟動子序列，如 SEQ ID N0:4所示的tRNA序列，如以SEQ ID N0:5所示的pCMV6-AC-GFP質粒序列為模板 PCR 擴增 SEQ ID N0:6 所示的 pCMV6-AC-GFP37TAG 質粒序列；
[0006] b)將所述hUPII啟動子與AcKRS基因，所述hTERT啟動子與tRNA分別連接到如 SEQ ID N0:7所示的psiCHECK-2質粒中構建重組載體；
[0007] c)將所述重組載體與所述pCMV6-AC-GFP37TAG質粒，共同轉入膀胱癌細胞，構建 出所述基因線路。
[0008] 所述膀胱癌細胞是5637。所述步驟c)中，將含有UAG終止密碼子的效應基因一起 轉入所述膀胱癌細胞。所述效應基因是綠色熒光蛋白GFP。
[0009] -種尿道上皮細胞特異啟動子hUPII與一種能在真核細胞編碼乙酰化賴氨酸的 氨酰tRNA合成酶AcKRS組成的DNA序列，hUPII序列如SEQ ID NO: 1所示，AcKRS序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0010] -種癌癥細胞特異啟動子hTERT與一種能在真核細胞編碼乙酰化賴氨酸的tRNA 組成的DNA序列，hTERT序列如SEQ ID NO: 3所示，tRNA序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011] 當將上述基因線路轉入膀胱癌細胞，并加入N-乙酰-L-賴氨酸時，綠色熒光蛋白 只在膀胱癌細胞中表達，而在正常細胞中不表達。
[0012] 一種膀胱癌檢測試劑盒，包括序列如SEQ ID N0:8所示的psiCHECK-2-hUPII/ AcKRS重組載體、序列如SEQ ID NO: 9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重組載體、序列如SEQ ID NO: 6所示pCMV6-AC-GFP37TAG質粒。所述的試劑盒，還包括含有UAG終止密碼子的效應 基因。所述效應基因是綠色熒光蛋白GFP。
[0013] 本發明的有益效果是：本發明將乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶AcKRS基因、乙酰 化賴氨酸tRNA分別構建在膀胱癌特異性啟動子下游，并與含有UAG終止密碼子的效應基因 綠色熒光蛋白GFP -起轉入細胞，構建的邏輯與門乙酰化賴氨酸基因線路只在膀胱癌細胞 中啟動乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶、乙酰化賴氨酸tRNA轉錄，在外源加入N-乙酰-L-賴 氨酸的條件下，表達全長的綠色熒光蛋白GFP ;而在其他類型細胞中，膀胱癌特異啟動子無 法同時啟動乙酰化賴氨酸tRNA和乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶的轉錄，綠色熒光蛋白GFP 基因翻譯時會在UAG終止密碼子處終止，不能表達全長的綠色熒光蛋白GFP ;從而可以通過 比較細胞綠色熒光強弱或者Western blot檢測GFP表達的方法，區分膀胱癌細胞和正常細 胞。
【附圖說明】
[0014] 圖1是跑膠檢測重組載體構建情況，其中，字符1代表Bglll/Xhol雙酶切后的 psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重組載體，箭頭所指 hUPII/AcKRS 的片段；2 代表 Bglll/Xhol 雙 酶切后的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重組載體，箭頭所指hTERT/tRNA的片段；3代表PCR定 點突變的PCMV6-AC-GFP37TAG重組載體，箭頭所指pCMV6-AC-GFP37TAG的片段；
[0015] 圖2是基因線路轉入細胞后，用熒光顯微鏡觀察含有UAG終止密碼子的GFP在正 常膀胱上皮細胞SV-HUC-I和膀胱癌細胞5637中的表達情況，字符1代表正常細胞，2代表 膀胱癌細胞；
[0016] 圖3是Western blot檢測GFP含有UAG終止密碼子的GFP在正常膀胱上皮細胞 SV-HUC-I和膀胱癌細胞5637中的表達情況，字符1代表正常細胞樣品，2代表膀胱癌細胞 樣品。
【具體實施方式】
[0017] L psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重組載體的構建
[0018] 擴增MJPII啟動子序列SEQ ID N0:1，正向插入psiCHECK-2質粒SEQ ID N0:7的 BgIII和Nhe 1酶切位點之間，即替換該載體中原有的啟動子SV40。將AcKRS基因序列SEQ ID NO: 2擴增出來，并裝載入突變的質粒psiCHECK-2-hUPII的NheI和XhoI之間。將AcKRS和 psiCHECK-2-hUPII酶切產物與T4連接酶混合，16度連接過夜，將酶連產物化轉ToplO感受 態細胞，37度培養過夜后，挑單克隆送樣測序，選取測序成功的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS 重組載體進行后續試驗。
[0019] PCR反應體系：
[0020]
[0021] PCR反應程序：
[0024] 限制性內切酶酶切反應體系：
[0026] T4連接酶連接反應體系：
[0028] 2· psiCHECK-2-hTERT/tRNA 重組載體的構建
[0029] 擴增 hTERT 啟動子序列 SEQ ID Ν0:3,正向插入 psiCHECK-2 質粒 SEQ ID Ν0:7 的BgIII和Nhel酶切位點之間，即替換該載體中原有的啟動子SV40。擴增tRNA序列SEQ ID N0:4,給兩端添加 NheI和XhoI位點，連入突變后的psiCHECK-2-hTERT。將tRNA和 psiCHECK-2-hTERT酶切產物與T4連接酶混合，16度連接過夜，將酶連產物化轉ToplO感受 態細胞，37度培養過夜后，挑單克隆送樣測序，選取測序成功的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重 組載體進行后續試驗，反應體系如前所述。
[0030] 3. pCMV6-AC-GFP37TAG 重組載體的構建
[0031] 以PCMV6-AC-GFP序列SEQ ID NO: 5為模板，通過PCR定點突變的方法擴增 PCMV6-AC-GFP37TAG序列SEQ ID NO:6,向PCR產物中加入DpnI酶切5小時，并將酶 切產物化轉ToplO感