采用敲除技術建立低磷性佝僂病模型的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 低磷性佝僂病（Hypophosphatemic rickets, HR)是一組因腎臟磷丟失導致血磷 降低，引起骨礦化異常的疾病。其分為四種亞型，臨床上X連鎖顯性低磷性佝僂病（XLH)最 常見，其發病率約為1/20000,可導致患者身材矮小，骨痛，牙齒發育異常，下肢畸形，以及 兒童出現佝僂病等。XLH的病因是PHEX基因失活突變引起的。
[0003] 人類疾病的病癥模型是疾病機理研究和新藥研發的重要基礎。因此建立人類疾病 模型，有效地模擬人類疾病的病理過程，能更有效地預測新疫苗、新藥和新診斷試劑等在臨 床應用中的效果，同時大大降低新藥研發的風險。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是采用CRISPR-CAS9基因敲除技術成功獲得人類低磷性佝僂病模 型的采用敲除技術建立低磷性佝僂病模型的方法。
[0005] 本發明的步驟是： ① SgRNA表達載體的構建：在PHEX基因第1個外顯子處設計2個SgRNA序列作用靶 點，合成兩對寡聚核苷酸鏈制備sgRNA，其中兩對寡聚核苷酸為： sgRNAl:TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG 和 AAACCCAGAGGCACTCGAATTG ; sgRNA2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC 和 AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG ; 合成的寡聚核苷酸經退火，退火條件是：95°C 5min后自然降至室溫，連入經Bbs I酶 切經回收PUC57-sgRNA表達載體，完成SgRNA載體構建； 其中：酶切體系：質粒HJC57 20 μ 1 IOXbuffer 20 μ I Bbs I 1 μ I ddH20 159 μ I 酶切37°C 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒進行回收； ② CAS9mRNA的合成：CAS9表達質粒經酶切線性化，經酚氯仿抽提純化后，溶于無核酸 酶的水中； 酶切體系：Not I 4 μ I CAS9 50 μ I BSA 30 μ I Triton 30 μ I IOXH 30 μ 1 CldH2O 156 μ 1 酶切37°C 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒進行回收； ③ 受精卵的獲取和顯微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人絨毛膜促性腺激素，獲取受 精卵，通過顯微注射儀器將預混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到細胞質中，其中CAS9mRNA 濃度為 150ng/ μ 1，sgRNA 濃度為 30ng/ μ 1 ; ④ 受精卵的培養和發育：將顯微注射的受精卵轉移到培養液中，置于37°C恒溫培養箱 中培養，發育到桑椹胚時期時，用吸卵針將單個胚胎轉移到離心管中。
[0006] 本發明sgRNA的寡聚核苷酸鏈選取原則：選取分數最高并堿基序列開頭為GG的寡 聚核苷酸鏈。
[0007] 本發明胚胎PHEX基因敲除情況鑒定方法： ① 胚胎裂解：胚胎裂解試劑為NP40,裂解條件為：56°C，Ih ;95°C，IOmin ; ② DNA測序鑒定胚胎基因型敲除情況：提取DNA，進行PCR，電泳鑒定，并進行DNA測序， 得到基因型鑒定結果； a、 設計PCR引物如下： 上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC 下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC ; b、 PCR反應體系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12. 5ul ddH20 9. 5ul ； C、PCR反應條件： 95°C預變性 7min;94 °C變性 30s，58°C退火 30 s，72 °C延伸 40s;30 個循環；72 °C延 伸 5min ; ③ PCR產物進行測序，測序結果在PHEX基因引物設計的打靶位點附近出現雙峰的情 況，選擇雙峰的樣品再次PCR，產物膠回收后進行連接PGM-T載體，轉化后挑取陽性克隆再 次進行測序，測序結果中在PHEX基因靶位點附近發生堿基插入或堿基缺失，導致閱讀框移 碼突變，則為基因敲除。
[0008] 本發明經過相關檢測，成功獲得低磷性佝僂病模型，該模型的獲得能夠有效地模 擬人類疾病的病理過程，能更有效地預測新疫苗、新藥和新診斷試劑等在臨床應用中的效 果，同時大大降低新藥研發的風險，為臨床研究提供基礎模型。
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明表達載體HJC57-sgRNA的結構示意圖； 圖2是本發明PCR產物鑒定胚胎PHEX基因敲除情況的電泳圖； 其中M =MarkerIII為DNA分子標準量；1-14 :顯微注射后14個胚胎DNA PCR結果。15 : 陽性對照(正常胚胎）；16 :水對照； 設計的PHEX基因的鑒定引物為448bp 從DNA測序結果和PCR產物電泳結果可得到：1，2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11，12,13, 14, 15 胚胎均發生不同的敲除情況； 圖3是顯微注射后得到的新生小兔經鑒定后，將對照組和敲除組分別記錄并統計其在 生長過程中體長的情況； 該圖為正常組和敲除組兔生長曲線，從圖上可以看出敲除組在生長發育過程中出現生 長發育遲緩現象； 圖4是顯微注射后得到的新生小兔經鑒定后，將對照組和敲除組分別記錄并統計其在 生長過程中體重的情況； 該圖為正常組和敲除組兔身高曲線，可以看出敲除組身高明顯低于正常組，并且生長 遲緩； 圖5是顯微注射后得到幼兔血清學鑒定結果：堿性磷酸酶含量對比；該圖表現出：正常 組和敲除組相比較，敲除組堿性磷酸酶的含量顯著升高； 圖6是顯微注射后得到幼兔血清學鑒定結果：磷含量對比；該圖表現出：正常組和敲除 組相比較，敲除組磷含量顯著減低。
【具體實施方式】
[0010] 本發明建立PHEX基因敲除低磷性佝僂病模型： 步驟如下： I) CRISPR-CAS9系統SgRNA設計和表達載體的構建。
[0011] 根據 Dr. Feng Zhang (http://crispr. mit. edu/)設計在 PHEX 基因第 1 個外顯 子處設計2個SgRNA序列作用祀點，合成兩對 寡聚核苷酸鏈（sgRNAl: TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG 和 AAACCCAGAGGCACTCGAATTG; SgRNA 2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC 和 AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG)用于制備 sgRNA。該 SgRNA 的 寡聚核苷酸鏈選取原則：選取分數最高并堿基序列開頭為GG的寡聚核苷酸鏈。合成的寡聚 核苷酸經退火（95°C 5min后自然降至室溫），連入經Bbs I酶切經回收PUC57-sgRNA表 達載體，完成sgRNA載體構建，通過測序驗證片段連接正確，進行克隆，擴大培養后提取質 粒用于準備體外轉錄模板。
[0012] 酶切體系：質粒HJC57 20 μ 1 IOXbuffer 20 μ I Bbs I 1 μ I ddH20 159 μ I 酶切37°C 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒(購于天根公司，北京， 中國）進行回收，具體操作按說明書進行。
[0013] CAS9表達質粒（Addgene，實驗室購買)，經酶切線性化，經酚氯仿抽提純化后， 溶于無核酸酶的水中作為模板，用于體外轉錄。CAS9mRNA的合成由試劑盒RNeasy Mini Kit(Qiagen，No. 74104)在體外作用T7RNA聚合酶來完成，sgRNA的體外合成由試劑盒 MiRNeasy Mini Kit (Qiasgen, No. 217004)在體外利用 T7RNA 聚合酶完成。
[0014] 酶切體系：Not I 4 μ I CAS9 50 μ I BSA 30 μ I Triton 30 μ I IOXH 30 μ I ddH20 156 μ I 酶切37°C 3h，電泳跑膠后，使用普通DNA瓊脂糖膠回收試劑盒(購于天根公司，北京， 中國）進行回收，具體操作按說明書進行。
[0015] 2)受精卵的獲取和顯微注射。
[0016] 注射卵泡刺激素（FSH)，之后注射人絨毛膜促性腺激素（HCG)(購于寧波第二激 素廠)，獲取受精卵，通過顯微注射儀器將預混好CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到細胞質中 (CAS9mRNA 終濃度為 150ng/ μ 1，SgRNA 終濃度為 30ng/ μ 1)。
[0017] 3)受精卵的體外培養和發育。
[0018] 將顯微注射的受精卵轉移到培養液中，置于37°C恒溫培養箱中培養，發育到桑椹 胚時期時，用吸卵針將單個胚胎轉移到離心管中，用于后面實驗。
[0019] (2)胚胎PHEX基因敲除情況鑒定 1) 胚胎裂解 胚胎裂解試劑為NP40,裂解條件為：56 °C Ih 95 〇C IOmin 2) DNA測序鑒定胚胎基因型敲除情況。 提取DNA，提取方法按照組織基因組提取試劑盒說明書進行操作(購于天根公司，北京， 中國），進行PCR，電泳鑒定，并進行DNA測序，得到基因型鑒定結果。
[0020] 設計PCR引物如下： 上游引物：GTCAACGCTTAACAGACTC 下游引物：CACCTCCAACCACTTAATAC 邊）PCR反應體系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12. 5ul ddH20 9. 5ul if} PCR反應條件： 95°C預變性 7min;94 °C變性 30s，58°C退火 30 s，72 °C延伸 40s;30 個循環；72 °C延 伸 5min〇
[0021 ] PCR產物進行測序，若測序結果在PHEX基因引物設計的打靶位點附近出現雙峰的 情況，則為打靶成功。選擇雙峰的樣品再次PCR，產物膠回收后進行連接PGM-T載體，轉化 后挑取陽性克隆再次進行測序，測序結果中在PHEX基因靶位點附近發生堿基插入或堿基 缺失，導致閱讀框移碼突變，則判斷為基因敲除。
[0022] 下面對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述： (1)建立兔PHEX敲除低磷性佝僂病模型。
[0023] 步驟如下：_ I) CRISPR-CAS9系統SgRNA設計和表達載體的構建。
[0024] 在PHEX基因第1個外顯子處設計2個sgRNA序列作用靶點，合成兩對 寡聚核苷酸鏈（sgRNAl: TAGGCAATTCGAGTGCCTCTGG 和 AAACCCAGAGGCACTCGAATTG; SgRNA 2:TAGGCTTGGCACGATCCTCTTTC 和 AAACGAAAGAGGATCGTGCCAAG)用于制備 sgRNA。該 sgRNA 的 寡聚核苷酸鏈選取原則：選取分數最高并堿基序列開頭為G的寡聚核苷酸鏈。合成的寡聚 核苷酸經退火（95°C 5min后自然降至室溫），連入經Bbs I酶切經回收PUC57-sgRNA表 達載體，完成sgRNA載體構建，通過測序驗證片段連接正確，進行克隆，擴大培養后提取質 粒用于準備體外轉錄模板。
[0025] 酶切體系：質粒HJC57 20 μ 1 IOXbuf