斑馬魚防御素defbl3的優化基因及其重組蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種密碼子經過優化的基因，尤其涉及按照畢赤酵母偏愛密碼子對斑 馬魚防御素 defbl3基因進行改造后的優化基因，以及其編碼的重組蛋白的制備方法，屬于 基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 綜觀國內養殖業，海水和淡水養殖區大多分布于沿海港灣和河口附近水域，這些 水域也是沿海陸源污染物和海上排污的主要受納場所。據統計，我國每年直接入海的廢 水量高達80億噸，富含營養物質、病原微生物和有機農藥的農業污水也隨地表流進沿海水 體，致使水體水質惡化。這樣的養殖環境污染導致水產養殖生物的抵抗力大大降低，目前針 對這種情況采取的主要措施是給水產生物過量服用抗生素，其直接后果就是微生物耐藥性 增加、水產品質量和安全問題日漸突出，并導致我國水產品出口遭受技術性貿易壁皇。據 此，開發無微生物耐藥問題、能夠替代或部分替代抗生素的綠色飼料添加劑對于水產生物 的養殖安全和水產食品安全來講刻不容緩。
[0003] 抗菌肽是由生物細胞特定基因編碼的一類具有抗菌免疫功能的小分子多肽，其抗 菌譜廣、不容易產生耐藥性、分子量小而耐熱性好，在機體天然免疫和獲得性免疫中發揮了 重要作用，被認為是抗生素替代品的最佳候選者，因此，極具開發應用前景。目前對于抗菌 肽的研究應用比較成熟的是昆蟲來源的抗菌肽，它們的應用領域主要是畜禽養殖業。相比 之下，對于水產生物來源抗菌肽的研究報道很少，更談不上應用。水產生物因其棲息的水域 環境比其他生物復雜而更易遭遇病原微生物的侵染，它們的機體必須擁有比其他生物更強 的免疫系統才能適應這種復雜的生存環境，而這種特殊的免疫系統得益于它們機體中多種 抗菌肽的適時表達。因此，水產生物來源的抗菌肽是水產養殖中飼用抗生素替代品的最佳 候選者。
[0004] 防御素是一類可殺死細菌、真菌或者病毒等微生物并有抗腫瘤活性的多肽，是抗 菌肽家族的重要成員。關于防御素基因工程制備的研究報道主要集中在人類來源和畜禽來 源的防御素，目前已經有人α -防御素5、人α -防御素2、豬β -防御素2等在畢赤酵母中 表達的報道或專利。近幾年隨著對魚類功能性基因的研究，逐漸發現了一些魚類來源的防 御素基因，如團頭魴β-防御素、虹鱒魚β-防御素、紅鰭東方飩β-防御素等。魚類來源 的β -防御素是一類富含精氨酸和半胱氨酸的堿性小分子肽，大部分含6個半胱氨酸殘基， 可形成3對二硫鍵以維持其穩定性。迄今為止，采用基因工程技術制備魚類來源防御素的 研究報道和專利很少，即便有，幾乎都是通過RT-PCR或從cDNA文庫獲得編碼抗菌肽的天然 cDNA，金俊琰等（金俊琰，周莉，桂建芳。石斑魚β -防御素的酵母表達及其產物抗菌活性 分析，水生生物學報，2011，35 (5) :739-743)從石斑魚cDNA文庫獲得編碼β -防御素的天 然cDNA，在酵母菌中表達了重組β -防御素成熟肽，具有一定體外抑菌活性，但表達量非 常低。張涓（團頭魴β -防御素基因的克隆、重組表達及抗菌活性研究。華中農業大學 碩士學位論文，2014年6月，條形碼Y2567756)通過RT-PCR從團頭魴中克隆到天然的編碼 β -防御素的cDNA，實現了在畢赤酵母中的表達，表達上清的體外抑菌活性測定結果顯示 具有一定的活性，但SDS-PAGE電泳始終未能獲得表達產物重組蛋白的條帶，他們分析認為 可能是表達量非常低以致無法檢測到。除了 β -防御素，還有關于魚類來源其他抗菌肽的 酵母表達研究的一些報道，如汪玉華等（汪玉華，敖敬群，陳新華。大黃魚抗菌肽hepcidin 在巴斯德畢赤酵母中的表達及其產物的抑菌活性，應用海洋學學報，2013, 32 (3) :383-389) 從cDNA文庫獲得編碼hepcidin的天然cDNA，在畢赤酵母中表達了重組hepcidin，表達產 物顯示了一定的抑菌活性，但他們并未提供純化的重組hepcidin的實驗結果，其原因可能 就是表達產量過低不易純化所致。迄今為止，報道的魚類抗菌肽的重組表達較少，一般在 實驗室水平進行的魚類抗菌肽在酵母中的表達研究方面，因為目的蛋白的表達量很低或 拿不到純品，都不太提及具體的表達量。對于其他來源的抗菌肽，雖然有文獻報道了其具 體的表達量，但是表達也不理想。例如蔡晶晶等（蔡晶晶，楊明，蔡靈，郭慶，潘瑞珍，王克 堅。黑鯛抗菌肽h印cidin在畢赤酵母中的表達，廈門大學學報，2009,48 (5) :738-743)在 畢赤酵母中表達黑鯛抗菌肽hepcidin，其表達量在120h達到最高為I. lmg/L。Feng-Iiang Jin 等人(Feng-liang Jin，Xiao_xia Xu,Xiao-qiang Yu,Shun-xiang Ren.Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Process Biochemistry 2009;44:11-16)利用密碼子優化后的基 因在畢赤酵母中表達家繩和天蠶抗菌肽，他們從100ml培養液中得到I. 8mg純肽（即表達 量約 18mg/L) 〇 Vasiliki Koliaraki 等人（Vasiliki Koliaraki, Martha Marinou, Martina Samiotaki, George Panayotou, Kostas Pantopoulos, Avgi Mamalaki. Iron regulatory and bactericidal properties of human recombinant hepcidin expressed in Pichia pastoris. Biochimie 2008 ;90:726-735)在畢赤酵母中表達得到人hepcidin，其在培養液 中的表達量為5-7mg/L。
[0005]目前，很多文獻報道了蛋白質的異源表達，表達量在原始菌株基礎上得到了很大 的提高，特別是利用畢赤酵母異源分泌表達蛋白質，具有高細胞密度發酵，蛋白質可分泌 到胞外表達且雜蛋白少；遺傳和表達穩定性好等諸多優點（Macauley-Patrick S, Fazenda M, McNeil B, et al. , Heterologous protein production using the Pichiapastoris expression system, Yeast, 2005, 22:249-270)。但畢赤酵母作為一種異源蛋白質表達宿 主，對于外源基因的表達具有相當的局限性，提高外源基因在畢赤酵母中的表達量通常 有密碼子優化、mRNA二級結構改造、GC含量調整等策略。密碼子優化是一種重要的高效 重組表達手段，它是根據宿主的密碼子偏愛性優化異源基因的密碼子以提高重組蛋白表 達效率，這在一些原核生物和真核生物中均有報道。研究結果認為密碼子優化提高了翻 譯效率從而提高了蛋白表達水平，進一步的研究發現密碼子優化能夠提高異源基因在真 菌中的轉錄活性即 mRNA 水平。HugoG Menzella(HugoG Menzella. Comparision of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Menzella Microbial Cell Factories, 2011，10:15)對小牛前凝乳酶 (calf prochymosin)基因進行密碼子的優化，其采用的隨機密碼子優化策略獲得了 5條 優化序列。在大腸桿菌中的表達結果表明，經隨機密碼子策略優化后的序列的表達水平都 較原始序列有明顯提高，其中一條優化序列更是提高了 70%。Jiangke Yang等（Jiangke Yang, Liying Liu. Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillusniger lip2gene in Pichiapastoris. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic