一種與他莫昔芬耐藥性相關的microRNA分子MiR-200a及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤生物治療領域，涉及一種與他莫昔芬耐藥性相關的microRNA分 子MiR-200a及其應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其高發病率嚴重威脅著女性的身體健康。 目前，以他莫昔芬為基礎的內分泌療法對雌性激素受體（ER)陽性乳腺癌患者的療效具有 重要意義。
[0003] 他莫昔芬是目前ER陽性乳腺癌治療的臨床一線用藥，該藥為雌二醇競爭性拮抗 劑，通過與雌二醇競爭性結合雌激素受體，減弱雌激素受體介導的腫瘤增殖轉移相關的信 號轉導，從而達到治療腫瘤的作用。但在肯定治療效果的同時，不得不承認腫瘤細胞產生耐 藥現象是ER陽性乳腺癌轉移和復發的重要原因，他莫昔芬出現的耐藥現象是限制其臨床 療效的主要原因。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種與他莫昔芬耐藥性相關的microRNA分子MiR-200a及 其應用。
[0005] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0006] 本發明公開了一種與他莫昔芬耐藥性相關的microRNA分子MiR_200a，MiR_200a 的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
[0007] 本發明還公開了上述的microRNA分子MiR-200a作為乳腺癌他莫昔芬耐藥標志物 的應用。
[0008] 所述的microRNA分子MiR-200a在雌性激素受體陽性乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞中 低表達。
[0009] 所述的microRNA分子MiR-200a在雌性激素受體陽性乳腺癌他莫昔芬敏感細胞中 高表達。
[0010] 本發明還公開了上述的microRNA分子MiR-200a在制備針對乳腺癌他莫昔芬耐藥 的藥物中的應用。
[0011] 本發明還公開了上述的microRNA分子MiR-200a作為設計抗乳腺癌他莫昔芬耐藥 的藥物靶點的應用。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0013] 本發明公開了一種與他莫昔芬耐藥性相關的microRNA分子，為MiR-200a，其核苷 酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。MiR-200a具有在ER陽性乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞中低表達、 在ER陽性乳腺癌他莫昔芬敏感細胞中高表達的特性，是一種新的乳腺癌他莫昔芬耐藥標 志物。因此，本發明為設計抗乳腺癌他莫昔芬耐藥的藥物提供了新的靶點，并以此為依據， 用以設計和開發直接針對乳腺癌他莫昔芬耐藥的新藥。本發明公開的MiR-200a具有促進 乳腺癌細胞耐藥的生物學功能及作用機制，為有效逆轉乳腺癌他莫昔芬耐藥及提高乳腺癌 的臨床化療效果提供有效途徑。
【附圖說明】
[0014] 圖1為構建MCF-7他莫昔芬耐藥細胞系（MCF-7/TR)，通過細胞增殖-毒性實驗檢 測MCF-7/TR對他莫昔芬的耐藥能力。
[0015] 圖2為Real-time PCR檢測MCF-7/TR及MCF-7親本細胞中MiR-200a的表達水平。
[0016] 圖3為細胞增殖-毒性實驗檢測轉染MiR-200a后構建的MCF-7/TR細胞對他莫昔 芬的耐藥能力。
[0017] 圖4為細胞增殖-毒性實驗檢測轉染MiR_200a antagomiR后乳腺癌MCF-7親本 細胞對他莫昔芬的耐藥能力。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0019] 他莫昔芬在乳腺癌的治療過程中發揮著重要作用，但出現的耐藥現象是限制其臨 床療效的主要原因。明確新的microRNA在乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥中的生物學功能和機 制為有效提尚乳腺癌的臨床療效提供新的生物革E標選擇。
[0020] 本發明公開了一種腫瘤耐藥microRNA分子，為MiR-200a，其核苷酸序列為 CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA 〇
[0021] 本發明還公開了 MiR_200a作為設計抗乳腺癌他莫昔芬耐藥藥物靶點的用途，以 及MiR-200a在乳腺癌他莫昔芬耐藥性的臨床診斷中的應用，以及根據這一靶點設計出的 藥物。
[0022] 1、構建MCF-7他莫昔芬耐藥細胞系（MCF-7/TR)
[0023] 采用高濃度短時間他莫昔芬沖擊法誘導MCF-7/TR耐藥細胞株。取對數生長期 的MCF-7細胞約個KT7,接種于直徑為IOcm的培養皿中，待細胞生長穩定后加入終濃度為 10 μ mol/L的他莫昔芬，2-3天換液1次，每次換液后加入等濃度的他莫昔芬。經過2月的 培養后，通過有限稀釋法獲得單克隆的乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐藥細胞，并在7d無藥物干 預下擴增細胞。為了維持MCF-7/TR耐藥細胞株的耐藥性，細胞長期在終濃度為2 μ mol/L 的他莫昔芬的培養液中培養。
[0024] 2、檢測MCF-7親本細胞及MCF-7/TR細胞中miR-200a的表達量
[0025] 1)引物設計
[0026] hsa_miR_200a_Primer Forward Primer(20 μ Μ)：
[0027] CATCTTACCGGACAGTGCTGGA。
[0028] 2)細胞總RNA提取
[0029] Α.整個RNA提取過程需要帶口罩和手套，并且在冰上操作，防止RNA降解。
[0030] B.將細胞用預冷的PBS洗滌兩次，每組樣品加入ImL提前預冷的Trizol，用加樣 槍反復吹打。
[0031] C.在冰上放置5min，保證細胞充分的裂解。
[0032] D.將上步處理的樣品轉入DEPC水處理過的1.5mL EP管中，加入200 μ L氯仿，上 下顛倒充分混勾搖勾，靜置5min使其分層。4°C 12000rpm離心15min，離心后吸取約500 yL 上層液體至新的I. 5mL DEPC水處理過的EP管中。
[0033] E.加入與D步等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻。
[0034] F.室溫靜置IOmin后，4°C 12000rpm離心15min，棄上清。加入ImL乙醇，可見有 白色沉淀析出。將洗滌后的乙醇洗干凈，后倒置在濾紙上，靜止一段時間，用20yL DEPC水 溶解。
[0035] G.定量提取的RNA :取2 μ L RNA溶解于98 μ L TE buffer中，用紫外分光光度計 測定其A260和A280值，分析RNA的純度。
[0036] 3)細胞總mRNA反轉錄
[0037] 取提取好的5 μ g總RNA，用TaKaRa公司的PrimeScript RT逆轉錄試劑盒進行反 轉錄實驗，反應體系如表1所示：
[0038] 表 1
[0040]反應條件為：37°C，15min ;85°