一種糜蛋白酶的制備方法及提高糜蛋白酶穩定性的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，涉及藥用糜蛋白酶的生化分離技術。具體地說是采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取糜蛋白酶。
【背景技術】
[0002]糜蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理和臨床上的功用主要有兩方面:一、消炎:對各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好療效。二、抗癌:能促進抗癌藥物向病灶滲透，促使化療藥物發揮作用，局部大劑量使用時作用更強。大劑量使用可治療多種腫瘤，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌等，并且無任何毒副作用或不良反應。
[0003]中國專利CN1944641A公開了一種糜蛋白酶的制備方法及提高糜蛋白酶穩定性的藥物組合物，采用親和層析工藝從糜蛋白酶原生產高純度糜蛋白酶，但是正如中國專利CN1013025B分析，也存在一些缺點，最主要的，親和層析介質昂貴，可重復使用次數少，介質的使用量大，不適合規模化大生產。而中國專利CN1013025B雖然解決了親和層析的不足，也能獲得高比活的糜蛋白酶，但同樣，比較起傳統工藝來，生產成本太高。可是隨著糜蛋白酶的應用廣泛，使得國際市場對本產品的需求不斷擴大，質量要求上也更加嚴格，要求產品有更高的質量:《中國藥典》(2010版)規定，糜蛋白酶的效價不得少于1000單位/毫克。針對效價提高的要求，本發明對傳統工藝進行了改進和創新。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了生產高質量的糜蛋白酶而又降低生產成本，對傳統工藝加以改造，尤其是參數的改造，提供了一種分離提取糜蛋白酶方法，該方法包括如下步驟:
1、糜蛋白酶粗制生產操作:
(1)新鮮的胰臟，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，絞碎，稱重；
(2)絞碎物置塑料桶中，按1?3ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸漬20?30小時；
(3)將浸漬物過濾，濾渣再按1?2ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸漬1?3小時，濾干后棄去濾渣；
(4)將兩次浸漬液合并置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，使達40%飽和度，靜置12?16小時；
(5)過濾，留取過濾液，固體棄去；
(6)在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，使達70%飽和度，放置12?16小時；
(7)過濾，留取固體，棄濾液；
(8)將沉淀物按2?4ml/g的比例加水溶解，再按(4)(5) (6) (7)操作法分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀； (9)取70%飽和度沉淀物，按1?3ml/g的比例加水溶解，再按0.2?1.5ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.5?5.5 ;
(10)將溶液靜置20?28°C恒溫箱中40?50小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品。
[0005]2、糜蛋白酶精制生產操作:
(1)結晶工序
投料:取糜蛋白酶粗品，按5?9ml/g的比例加水溶解，調pH值至2.5?3.5，攪拌8?10小時后，靜置12?16小時；
結晶I
靜置結束后攪拌，并調pH值至2.0?3.0。按1?3ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，攪拌10?30分鐘，調pH值至4.5?5.5，置20?28°C條件下，保溫40?48小時，過濾，收集濾餅，濾液棄去；
結晶II
按2?4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0?3.0，再按0.5?2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.5?5.5，置20?28°C條件下，保溫20?24小時，過濾，收集濾餅；
結晶III
按2?4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0?3.0，再按0.5?2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.5?5.5，置20?28°C條件下，保溫20?24小時，過濾，收集濾餅；
結晶IV
按2?4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調pH值至2.0?3.0，再按0.5?2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調pH值至4.5?5.5，置20?28°C條件下，保溫20?24小時，過濾，收集濾餅。
[0006](2)活化工序
稱量濾餅重量，按2?4ml/g的比例加入水溶解，調pH值至7.0?8.5 ;
再按0.5?1.5ml/g濾餅的比例加入磷酸鹽緩沖液，攪拌，調節pH值至7.0?8.5。加入活化劑胰蛋白酶，比例為3?8mg/100ml料液，活化60?80小時。
[0007](3)鹽析工序
活化結束后調pH值至3.0?5.0，量取活化液體積，按400?600g/L的比例加入固體硫酸銨進行鹽析，放置12?16小時；過濾，棄濾液，收集濾餅。
[0008](4)透析工序
濾餅按1?1.5ml/g的比例加入7jc，攪拌溶解，透析4?6天。
[0009](5)凍干工序
收集、合并透析液，過濾，量取體積，調pH值至5.5?6.7，裝盤、凍干。
[0010]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
本發明采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取糜蛋白酶，通過對傳統工藝的改進和創新，不僅生產出了高質量的糜蛋白酶，同時又具有簡單、低成本等優點。
[0011]本發明已建立起一套規模化的生產工藝，制備的糜蛋白酶精品效價高達1200單位/毫克以上，符合《中國藥典》(2010版)要求，具有極大的市場競爭力。
【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0013]實施例1
1、糜蛋白酶粗制生產操作:
(1)稱取新鮮冷凍的牛胰臟4kg，立即用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，絞碎，稱重；
(2)絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液6L浸漬22小時；
(3)將浸漬物過濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液4L浸漬1小時，濾干后棄去濾渣；
(4)將兩次浸漬液合并，量取體積11.4L，置塑料桶中，加入固體硫酸銨2.76kg，使達40%飽和度，靜置12小時；
(5)過濾，留取過濾液，量取體積10.2L,固體棄去；
(6)在過濾液中加入固體硫酸銨2.1kg，使達70%飽和度，放置12小時；
(7)過濾，留取固體，稱重116g，棄濾液；
(8)將沉淀物用232ml純化水溶解，再按(4)(5) (6) (7)操作法分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀；
(9)取70%飽和度沉淀物65g，用65ml純化水溶解，加入飽和硫酸銨溶液19.5ml，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調pH4.7 ;
(10)將溶液靜置20°C恒溫箱中42小時，即有針狀結晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽濾，即得糜蛋白酶粗品，稱重20.0g。
[0014]2、糜蛋白酶精制生產操作:
(1)結晶工序
投料:取糜蛋白酶粗品20.0g，加100ml純化水溶解，并加適量2.5mol/L H2S04溶液調節pH2.6，攪拌8小時后，靜置12小時；
結晶I
靜置結束后攪拌，并加2.5mol/L H2S04溶液調pH2.1。加入飽和硫酸銨溶液20ml，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調pH4.6，置20°C條件下，保溫40小時，過濾，收集濾餅，稱重37.6g，濾液棄去；
結晶II
濾餅加76ml純化水溶解，用2.5mol/l硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液18.8ml，用5mol/L NaOH調pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重33.lg ；
結晶III
濾餅加66.2ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液16.6ml，用5mol/L NaOH調pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重30.7g ；
結晶IV
濾餅加61.4ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調pH2.0，加飽和硫酸銨溶液15.4ml，用5mol/L NaOH調pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時，過濾，收集濾餅，稱重30.4g。
[0015](2)活化工序加