雜交瘤細胞株imi-g12及其產生的新煙堿類農藥通用單克隆抗體和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于小分子化合物的免疫分析快速檢測領域，具體涉及一種雜交瘤細胞株 HO-G12及其產生的抗6種新煙堿類農藥的通用單克隆抗體，可用于吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲 胺、噻蟲啉、啶蟲脒和烯啶蟲胺這6種氯代煙堿類農藥的多殘留快速篩查。
【背景技術】
[0002] 新煙堿類農藥是在煙堿結構研究的基礎上，于20世紀80年代起開發、篩選和合成 出來的一類新型殺蟲劑。它作為激動劑，能選擇性作用于昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體，阻斷昆 蟲中樞神經系統的正常傳導，從而致使害蟲出現麻痹進而死亡。其不僅具有高效、廣譜及良 好的根部內吸性、觸殺和胃毒作用，而且對哺乳動物毒性較低，對環境相容性較好。此外，由 于這類殺蟲劑的作用靶標和方式與以往的有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類等殺蟲劑不 同，它們之間不存在靶標交互抗性。因此，新煙堿類農藥在殺蟲劑市場所占的比例日趨增 長，目前已商品化的有吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺和由我國 自主研發的氯噻啉共8個品種（圖1)。然而，近年來有研究報道了新煙堿類農藥對傳粉昆 蟲、鳥類生殖系統和老鼠呼吸系統等方面的負面影響，特別是歐美等國調查發現該類農藥 對蜜蜂存在巨大的潛在危害。歐盟已于2013年發布報告并建議新煙堿類農藥禁止用于由 蜜蜂進行授粉的作物。所以，建立新煙堿類農藥多殘留的快速分析方法尤為重要。
[0003] 常規的新煙堿類農藥殘留檢測方法有氣相、液相色譜及質譜聯用等儀器分析法， 其靈敏度高、準確性好，但設備條件要求高、前處理復雜，難以滿足大批量樣品現場快速檢 測的需求。近些年發展起來的免疫化學分析技術克服了上述不足之處，具有高靈敏度、高特 異性、對環境污染小、適于快速檢測等優點。迄今，國內外公開報道有關新煙堿類農藥的免 疫分析方法如酶聯免疫分析法都只是針對一個或兩個品種，這主要因為采用的是高特異性 抗體，即該抗體只能識別一個靶標分析物或者只與其結構高度類似物有部分交叉識別（如 氯噻啉抗體對吡蟲啉的識別能力最為接近）。若要同時篩查8種新煙堿類農藥，則必須進 行7-8輪免疫分析測定，這大大增加了檢測時間和成本。因此，為實現新煙堿類農藥多殘留 的快速檢測，需要獲得該類農藥的通用抗體來建立合適的新煙堿類農藥多殘留免疫分析方 法。目前國內外有關研制單個新煙堿類農藥高特異性抗體的報道已有不少，但有關新煙堿 類農藥通用抗體及其通用ELISA檢測方法尚未見公開報道。
[0004] 由于免疫細胞庫的多樣性，淋巴細胞分泌的單抗也是高豐富度的，因此篩選出能 同時識別幾個結構類似化合物的通用單克隆抗體是可行的。目前有關農藥類特異性通用單 抗的報道，主要集中在有機磷類、擬除蟲菊酯類和三嗪類農藥，關于新煙堿類農藥的通用抗 體制備尚未見公開報道。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、類選擇性強的可同時檢測6種新 煙堿類農藥的通用單克隆抗體，用于建立靈敏度高、類選擇性強的新煙堿類農藥多殘留免 疫分析方法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供了一種雜交瘤細胞株HO-G12,保藏單位：中 國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:C2015179,保 藏時間2015年10月28號。
[0007] 該細胞株頂I-G12能分泌產生抗6種新煙堿類農藥的通用單克隆抗體，抗體亞型 為重鏈IgGl和輕鏈lambda。據此建立的間接競爭ELISA法能用于吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲胺、 啶蟲脒、噻蟲啉和烯啶蟲胺這6種氯代煙堿類農藥的多殘留快速篩查（同時篩查）。
[0008] 在發明過程中，通過分析圖1所示的8種新煙堿類農藥的化學結構，根據藥效團 可以分為N-硝基胍基團類（吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺）、N-氰基脒類（啶 蟲脒和噻蟲啉）和硝基甲撐（烯啶蟲胺）。因此，在篩選雜交瘤細胞株的時候，可以采用多 靶標物測試的篩選方式，如優先選擇吡蟲啉和啶蟲脒兩個最具代表性的農藥（使用也最廣 泛）進行同時測試，以期望獲得能識別多種新煙堿類農藥的通用型單抗。
[0009] 具體如下：
[0010] 本發明提供的雜交瘤細胞株頂I-G12是通過三步ELISA法并結合多靶標物測試的 篩選方式所獲得的：第一步，采用基于吡蟲啉-OVA包被的間接非競爭ELISA法篩選出能識 別吡蟲啉半抗原、而不識別載體蛋白BSA的陽性細胞孔；第二步，采用間接競爭ELISA法對 第一步獲得的陽性細胞孔上清進行鑒定，同時以吡蟲啉和啶蟲脒兩種農藥為競爭物，挑選 出受兩者抑制反應明顯（大于50%)并且非競爭對照孔吸光值高（0D>1)的有效細胞孔；第 三步，將第二步獲得的細胞孔擴大培養后的上清進行再次鑒定，同時以氯噻啉、噻蟲胺、噻 蟲啉、烯啶蟲胺、呋蟲胺和噻蟲嗪其它6種新煙堿類農藥作為競爭原，通過間接競爭ELISA 法篩選出識別農藥種類最多、受抑制程度明顯的細胞孔。然后，將此細胞孔經3-4次有限稀 釋亞克隆化，采用上述第二步的間接競爭ELISA法進行鑒定，獲得能穩定分泌新煙堿類農 藥通用單抗的細胞株IMI-G12。該通用單抗的大批量制備可通過細胞株擴大培養并傳代、收 集上清并濃縮得到，或者通過細胞株注射小鼠腹腔制備腹水的方式獲得。
[0011] 用吡蟲啉抗原包被的間接非競爭酶聯免疫吸附分析方法（ELISA)測定頂I-G12的 小鼠腹水抗體效價達到了 32, 000 ;進一步利用此新煙堿類農藥通用抗體和吡蟲啉包被抗 原建立并優化了間接競爭ELISA法，對氯噻啉、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲啉、啶蟲脒和烯啶蟲胺 的檢測靈敏度1(： 5。(50%抑制濃度）為0.34-3.64即/1^，平均1(：5。為1.721^/1^，是目前公 開報道的識別譜最寬泛的新煙堿類農藥通用ELISA法。
[0012] 綜上所述，本發明獲得了能分泌抗多種新煙堿類農藥通用抗體的雜交瘤細胞株， 且相應建立了 6種新煙堿類農藥通用ELISA檢測技術。采用本發明的新煙堿類農藥通用抗 體所建立的ELISA方法，可用于吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲胺、噻蟲啉、啶蟲脒和烯啶蟲胺這6種 氯代煙堿類農藥的多殘留快速檢測，具有靈敏度高、類選擇性好、檢測通量高、實用性強等 優點。
【附圖說明】
[0013] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0014] 圖1為八種新煙堿類農藥的化學結構；
[0015] 圖2為間接競爭ELISA法對六種農藥的標準曲線。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 :雜交瘤細胞株頂I-G12的制備
[0017] 1.新煙堿類農藥人工抗原的制備與動物免疫
[0018] 選用新煙堿類農藥的最具代表性品種吡蟲啉作為半抗原的起始原料，根 據 Wanatabe 等人(Development of competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on monoclonal antibodies for chloronicotinoid insecticides imidacloprid and acetamiprid. Anal Chim Acta, 2001，427(2) :211-219)建立的方法獲得 吡蟲啉的半抗原，并利用活化酯法制備出吡蟲啉-BSA偶聯物作為免疫抗原，同時利用混合 酸酐法制備出吡蟲啉-OVA偶聯物作為ELISA檢測抗原。
[0019] 取6-8周齡的Balb/C雌性小鼠3只，將制備的免疫原吡蟲啉-BSA與等體積的弗 氏完全佐劑進行預處理（油包水乳化），皮下多點免疫小鼠（100 μ g/只），三周后使用弗氏 不完全佐劑進行加強免疫，然后每隔兩周一次加免，小鼠腹腔注射（100 μ g/只）。每次加 免后第8天，小鼠尾巴靜脈采血監測效價，采用10 μ g/mL包被酶標板（100 μ L/孔），間接 非競爭ELISA法測定。第3次加免后，3只小鼠的血清效價（即OD值接近1. 0時的抗血清 稀釋倍數）均達到了 16, 000以上，同時采用吡蟲啉和啶蟲脒作為目標分析物進行間接競爭 ELISA法測試，選擇效價較高且對上述兩種農藥識別性能都較高的抗血清對應小鼠優先進 行末免。末免時不加佐劑，直接以生理鹽水稀釋免疫原吡蟲啉-BSA，免疫劑量同上。
[0020] 2.細胞融合與雜交瘤篩選
[0021] 末免后第4天，采用經典的雜交瘤技術將小鼠骨髓瘤細胞SP2/0和免疫脾細胞按 1:5的比例在50% PEG 1450條件下進行細胞融合。當細胞集落長到96孔板底的1/3-1/2面 積大小（細胞融合后第12天左右），首先第一步篩選，采用基于10 μ g/mL吡蟲啉-OVA包被 的間接非競爭ELISA法篩選出能識別吡蟲啉半抗原、而不識別載體蛋白BSA的陽性細胞孔 (OD 450nniM);第二步，采用5 μ g/mL吡蟲啉-OVA包被的間接競爭ELISA法對上述獲得的陽性 細胞孔上清進行鑒定，同時以吡蟲啉和啶蟲脒兩種農藥（濃度為500ng/mL)為競爭物，挑選 出受兩者抑制反應均明顯（大于50% )并且非競爭對照孔吸光值較高（0D4Mnni