A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白及疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于口蹄疫免疫技術領域，具體涉及一種A型口蹄疫基因工程復合表位蛋 白及疫苗。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起偶蹄動物的一種急性、高度接觸性、發熱性傳染病，以傳播迅 速、感染率高而著稱。該病一旦暴發將會造成巨大的經濟損失。FMDV有七個血清型，分別為 0、A、C、Asia l、SATl、SAT2、SAT3〇
[0003] 我國口蹄疫流行由來已久，目前流行的血清型主要有0型和A型。Asia 1型處于 基本控制狀態（自2009年5月以后至今近6年時間內亞洲I型在我國再未發生)。0型的流 行有所緩和，A型流行增加，豬發病病例增多。2009年A型東南亞拓撲型（A/SEA-97/G1)引 發牛口蹄疫，2012年2月至2013年1月無臨床病例、但病原廣泛存在。2013年2月A型東 南亞拓撲型病毒的另一分支（A/SEA-97/G2)引起廣東茂名豬發生FMD，截止同年8月A型在 全國發生16起，波及廣州、云南、青海、西藏和新疆5個省（自治區）。同時，東南亞地區國家 還存在A/IRAN/05等較多譜系的A型口蹄疫病毒，疫情形勢復雜，時刻威脅著我國畜牧養殖 業的健康發展。不同譜系A型口蹄疫病毒的抗原性變異較大，交叉免疫保護作用較差，給疫 苗研究帶來了困難。研究抗原譜廣的疫苗產品，將為我國口蹄疫防控提供重要的技術支撐。
[0004] 在FMD流行的國家，疫情的控制仍然依賴于現有的傳統滅活疫苗以及當地獸醫工 作者的辛勤勞動，通過強制性高強度的免疫，逐步減少疫情的發生。但是由于口蹄疫病毒本 身免疫原性弱，以及滅活疫苗生產成本的限制等因素，造成疫苗的免疫持續期較短，保護水 平較低，而且個體差異較大，保護性抗體產生的水平不整齊；同時滅活疫苗的生產需要高級 別的防護措施以消除病毒逃逸等安全隱患；而且，非純化的滅活疫苗多次免疫會產生非結 構蛋白抗體，給感染動物與免疫動物的鑒別診斷帶來困難。另外，接種全病毒滅活疫苗不能 阻斷病毒的持續感染狀態。由于這些因素，促使人們研制更加高效安全的新型FMD疫苗。隨 著國內外免疫學研究的深入、以及抗原遞呈機理與方法的研究進展，在疫苗分子設計、復合 表位疫苗與免疫佐劑等方面都取得了明顯進展。
[0005] 與傳統滅活疫苗相比，口蹄疫復合表位蛋白疫苗具有以下的優點：生產過程不涉 及感染性的FMDV，不存在散毒的危險；在同一種表位蛋白中引入多個譜系的保護性抗原表 位，拓展表位蛋白的抗原譜，從而使表位蛋白疫苗所誘導產生的免疫應答更具有廣譜性；通 過與通用的T細胞表位融合設計，形成復合表位蛋白，刺激產生更全面的體液免疫與細胞 免疫應答；利用非疫苗用病毒蛋白建立的診斷方法可對疫苗免疫動物和自然感染動物進行 有效區分，從而可準確評估動物的感染狀況，為疫病防控提供準確的監測技術支撐。口蹄疫 表位蛋白疫苗彌補了目前傳統疫苗所存在的諸多不足，成為口蹄疫新型疫苗發展的主要趨 勢之一。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服現有技術的疫苗缺陷，提供一種A型口蹄疫基因工程復合表 位蛋白和疫苗，利用該疫苗免疫動物，能夠產生很好的保護性免疫效果，是一種安全、高效 的口蹄疫新型分子疫苗。
[0007] 本發明的第一個目的是提供一種A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白，所述復合表 位蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 本發明的A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白包含由A/SEA/97，A/IRA/05，A22三 個譜系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位區、通用T細胞表位以及表位間的間隔序列 串聯組成，表位間的間隔序列有助于蛋白形成穩定的空間結構，提高蛋白的免疫原性；并在 重組蛋白末端融合的6個組氨酸標簽，以便于表位蛋白的分離純化。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種核苷酸序列，編碼權利要求1所述的A型口蹄疫 基因工程復合表位蛋白； 作為優選，所述核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 1。
[0010] 本發明的第三個目的是提供一種A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白疫苗，所述疫 苗包含權利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白，和藥學上可接受的媒介物； 作為優選，所述疫苗包括權利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白和Toll 樣受體9的配體CpG。
[0011] 作為優選，所述疫苗由水相和油相按比例混合后制備而成；所述水相的溶質為權 利要求1所述的A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白和Toll樣受體9的配體CpG ;所述油相 為 Montanide ISA-201 油佐劑。
[0012] 作為優選，所述的A型口蹄疫基因工程復合表位蛋白與Toll樣受體9的配體CpG 的重量比為5: (2-4)。
[0013] 作為優選，所述水相和油相的體積比為1: (0.95-1.05)。
[0014] 作為優選，所述疫苗的主要組分含量為復合表位蛋白250 μ g/mL，CpG佐劑150 μ g/mL ; 作為優選，免疫有效量為成年動物每頭份2 mL，幼年動物每頭份I mL。
[0015] 本發明的第四個目的是提供上述疫苗的制備方法，將權利要求1所述的A型口蹄 疫基因工程復合表位蛋白和Toll樣受體9的配體CpG溶于磷酸鹽緩沖液中，得到水相；將 水相與油相等溫度充分混合，乳化，得疫苗。
[0016] 本發明的第五個目的是提供上述疫苗在制備預防和/或控制A型口蹄疫病毒的藥 物中的應用。
[0017] 作為優選，所述疫苗在制備預防和/或控制豬、牛或羊A型口蹄疫的藥物中的應 用。
[0018] 經實驗，應用本發明的疫苗免疫動物，一周后就可檢測到A型FMDV特異性抗體，抗 體效價不斷升高，免疫四周時抗體效價最高。用A型口蹄疫流行毒攻毒后，疫苗免疫組豬均 可完全抵抗強毒攻擊。疫苗效力試驗結果表明，該疫苗每頭份的效力為10. 81 PD50,能夠作 為一種新型A型口蹄疫基因工程疫苗使用。
【附圖說明】
[0019] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為重組菌A8抗原表達產物SDS-PAGE ;其中，M為蛋白分子量Marker ;1為未誘導 的重組菌pET28a-A8對照；2為重組菌pET28a-A8誘導3小時產物；3為重組菌pET28a-A8 誘導5小時產物； 圖2為重組菌A8抗原Western Blotting檢測結果圖；其中，M為預染的蛋白分子量 Marker ;1為未誘導的重組菌pET28a-A8對照；2為誘導的pET28a載體對照；4, 5為重組菌 pET28a-A8誘導表達產物； 圖3為A8抗原表達純化后SDS-PAGE分析圖。M蛋白分子量Marker ; 1為pH值為5. 9 的洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白；2為pH值為4. 5的洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白。
【具體實施方式】
[0020] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0021] 試劑 1、IX IB Wash Buffer :EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH 7. 5，Triton X-100 l%〇
[0022] 實施例1 I、A8免疫原的設計與表達 本申請人根據國內外A型口蹄疫流行病學信息，設計并合成了免疫原基因 A8。其中AS 包含A/SEA/97, A/IRA/05, A22三個譜系中不同流行毒株的主要中和性抗原表位區以及通 用T細胞表位，各表位之間以甘氨酸-甘氨酸（GG)、甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GGC)或甘 氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸（GPGPGC)的間隔氨基酸序列相連，以 形成穩定的蛋白空間結構，最后加6組氨酸標簽序列，以有利于表達蛋白的純化。設計好的 序列交由南京GenScript公司進行編碼序列的優化與合成，兩端分別加入Nco I酶切位點/ 啟始密碼子與終止密碼子Hind III酶切位點，合成序列經Nco I/Hind III酶切位點插入 pET28a載體中，用于復合表位蛋白A8的表達。編碼復合表位蛋白的核苷酸序列如下，為序 列表中SEQ ID No. 1，其蛋白序列為序列表中SEQ ID No. 2。
[0023] ATGGCTAAGT TCGTGGCTGC ATGGACGCTG AAAGCAGCAG CCGGTGGTTG CGTGTACAGC GGTACATCCA AATATTCTGC CCCTCAAAAT CGTCGCGGCG ATAGCGGACC ACTGGCAGCA CGTCTGGCAG CTCAGCTGCC GGCATCCTTC AACTTTGGTG GTGCCGTGGA AGTCAGCTCC CAGGACCGCC ACAAACAAAA GATCATTGCA CCAGCCAAAC AAGGCGGAGT GTACTCAGGT ACTAGTAAGT ATAGTGCGTC GCAGAATCGT CGCGGCGATC TGGGCCCTCT GGCTGCTCGC CTGGCTGCTC AGCTGCCAGC TAGCTTCAAC TTTGGACCTG GTCCCGGCTG CGTCTACAAT GGCGTTTCGA AGTATAGCAC CACTGGAAAT GGTCGTCGCG GAGATCTGGG TTCTCTGGCA GCACGTGTCG CAGCTCAGCT GCCTTCTTCA TTCAACTTTG GTGGCGCAGT TGAGGTGCTG TCACAGGACC GCCATAAACA AAAGATCATT GCCCCCACCA AACAGGGTGG TGTGTACTCC GGTACTTCTA AGTATTCAGC ACCACAGAAC CGTCGCGGCG ACCTGGGTCC GCTGGCTGCT CGCCTGGCCG CTCAGCTGCC TGCGTCCTTC AACTTTGGCC CGGGACCAGG TTGCGTTTAC AATGGCACGA CAAAATATTC TACGGGTAAC GCAGGACGTC GCGGCGATTT AGGCTCACTG GCAGCACGTG TGGCAGCTCA ACTGCCAGCG AGCTTCAATT TTGGCGGAGC TGTCAAGGTT ACCAGCCAGG ACCGTCACAA ACAACGCATC ATTGCGCCGG CTAAGCAGGG TGGCGTGTAC AACGGCACGA GTAAGTATTC GGCACCAGCA ACACGTCGCG GCGATCTTGG CAGTCTGGCT GCTCGTCTGG CTGCCCAGCT GCCAGCATCG TTCAACTATT GCGGTGGCAC CGCCAAATCT AAAAAGTTCC CATCCTACAC CGCCACCTAT CAGTTCCACC ACCACCATCA CCACTAA 上述序列中各段核苷酸編碼氨基酸序列的來源與功能如下表1所示。
[0024] 表1. A8復合表位蛋白編碼序列中各段氨基酸來源與功能
各表位間的間隔氨基酸序列不同時