具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明是關于側鏈有硫醇基的D-型或L-體氨基酸衍生物的制造方法。此外，本 發明是關于在側鏈有硫醇基的D-型或L-體氨基酸衍生物的制造方法所使用的中間體。
【背景技術】
[0002] 近年，生物醫藥的研究開發的進展，由合成肽及蛋白質進行構造及機能的解析之 例，及將肽及蛋白質作為醫藥使用之例正增加。肽及蛋白質是由氨基酸構成，構成蛋白質的 氨基酸除了側鏈取代基是氫原子的情況外，α碳原子是不對稱原子之故，有稱為D-型 及L-體的鏡像異構物存在。在生物體內存在的肽及蛋白質，由L-氨基酸所構成，所以要合 成在生物體內存在的肽及蛋白質，其原料需要是有光學活性的L-氨基酸。此外，近年來，在 蛋白質的構造解析上，期待提高蛋白質的結晶化效率，而使用消旋蛋白質的X射線結晶構 造解析受到注目。其中，消旋蛋白質就是作為僅由D-氨基酸所組成的蛋白質與僅由L-氨 基酸所組成的蛋白質的等量混合物的蛋白質。解析蛋白質的構造是理解蛋白質機能的重要 的知識。為了由這種消旋蛋白質的結晶化而進行構造解析起見，合成D-蛋白質及L-蛋白 質的雙方的需要性提高。要將這種D-蛋白質及/或L-蛋白質制造并安定的供給，則有必 要將作為原料的光學活性D-氨基酸、L-氨基酸各分別大量以高效率制造。特別是，D-蛋白 質為天然不存在，只有由化學合成才有合成的可能，成為原料的D-氨基酸的工業生產是必 要不可欠的。
[0003] 此外，要合成高分子的蛋白質時，以固相合成等制造肽的方法，則能制造的肽的 長度有限，所以需要將所制造的肽連結起來。肽結合法而言，是采用名為自然化學接合法 NCL(Native Chemical Ligation)的方法。在NCL中，將N末端具有在側鏈有硫醇基的氨基 酸的肽，與其他肽的C末端，利用硫醇基的反應性而結合。因而，在NCL中，主要是在側鏈有 硫醇基的氨基酸的半胱氨酸作為結合部位而設計蛋白質合成。此外，在使用硫醇基的結合 反應后將構造改變為其他的氨基酸，而想出以丙氨酸等作為結合部位的方法等。但是，雖然 如此，可能作為結合部位的氨基酸仍舊是非常有限，這一點成為蛋白質合成的限制因素。
[0004] 因而，高分子的D-或L-蛋白質的制造上，要制造可作為NCL的結合部位的氨基酸 的話，需要制造在側鏈經導入硫醇基的光學活性D-或L-氨基酸。但是，這種氨基酸的制造 方法而言，以D-或L-氨基酸作為原料，有嘗試不要發生異構化而經由多數的復雜的步驟而 在側鏈導入硫醇基的方法，但由這種方法要以高收量及高收率制造目的之氨基酸是非常困 難。并且，制造光學活性氨基酸的方法而言，亦存在有關使用立體選擇性的酶的方法等的報 告（參照專利文獻1，2)。但是，在這些中，沒有特別述及在側鏈有硫醇基等的所希望的取 代基的氨基酸的制造等。此外，酶有基質特異性，所以對于在β位有例如經保護的硫醇基 之容積大的取代基的氨基酸衍生物也不能說酶有效。隨后高分子的D-或L-蛋白質的制造 上，可作為NCL的結合部位使用之光學活性β -硫代氨基酸衍生物，至今為止，還沒有達到 以可使D-或L-蛋白質的工業生產的實施方案而制造的程度。
[0005] [先前技術文獻]
[0006] [專利文獻]
[0007] [專利文獻1]日本專利特開平6-125786
[0008] [專利文獻2]日本專利特開平11-69992
【發明內容】
[0009][發明要解決的課題]
[0010] 本發明的課題是提供在側鏈有硫醇基的光學活性的D-型及/或L-型氨基酸，能 以簡易的方法，以高收率制造的方法為課題。特別是，本發明人，為了要增加可作為由NCL 的結合部位的氨基酸的變化，將側鏈有硫醇基的天然型或非天然型的各種D-或L-氨基酸， 以高收率制造作為課題。
[0011][解決課題的手段]
[0012] 本發明人為了要解決前述課題精心進行研究。根據光學活性D-或L-氨基酸作為 原料的以往方法，不對稱碳原子的立體異構的調控非常困難。于是，本發明人刻意將有硫醇 基的氨基酸衍生物作為立體異構物混合存在的中間體組合物而制造之后，使用酶將α碳 原子的D-型與L-型分離，驚訝的是發現以比以往較少的步驟數的簡易方法，以高收率，而 可制造在側鏈有硫醇基的光學活性氨基酸衍生物。即，本發明人著眼于，在NCL法中，可使 用將用于肽結合反應的硫醇基在結合反應后除去的方法。本發明人想到，將在β位有硫醇 基的氨基酸衍生物（β-硫代氨基酸衍生物），不實施α及β碳原子的立體異構的調控，在 最后作為α碳原子以光學活性體精制所得者可用于NCL的結合部位。即，α及β碳原子 是不對稱原子的β -硫代氨基酸衍生物的D-型或L-型，由在NCL反應后除去硫醇基，則可 變成只有α碳原子為不對稱碳原子的α碳原子的光學活性D-型或L-型，而可合適當作 用于NCL結合部位的氨基酸而使用。
[0013] 再者，本發明人，為了要制造對天然型或非天然型的各種的氨基酸經導入硫醇基 的光學活性衍生物，精心檢討作為中間體的立體異構物混合存在的氨基酸衍生物組合物的 制造方法。其結果，本發明人發現，由使用芳族氨基酸或甘氨酸作為原料，對包括天然型氨 基酸的各種的氨基酸在側鏈經導入硫醇基的非天然型氨基酸，可簡易且以高收率制造成為 D-型或L-型氨基酸。
[0014] 即，本發明是提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基的D-或L-非天然型氨基 酸衍生物的制造方法。該制造方法的特征在于，制造包括D-型及L-型之在β位有經保護 或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物，對所得的氨基酸衍生物使D-或L-氨基酸選擇性水 解酶中的任一種酶反應，隨后分離經水解的D-或L-氨基酸衍生物。
[0015] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基的 D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其特征是含有以下的步驟，
[0016] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應，而制造含有D-型及L-型，在β位有經保 護或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0017] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導入保護或無保護的硫醇基的反應，
[0018] 以及，
[0019] (B)將結合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，轉變為要成為D-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質的取代基的反應，
[0020] 以及，
[0021] (II)對（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶中的任一種酶 反應，隨后分離經水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0022] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基及 取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R1是指構成氨基酸的側鏈的取代基中， 結合在β碳原子的取代基部分而言（但，氫原子的情況除外）。]的制造方法。
[0023] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于前述"在β位有經保護或未經保護的 硫醇基及取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法"中，
[0024] 在前述步驟（I)中，前述反應（A)之前，包含作為步驟（P)之制造在β碳原子有 取代基R 1及脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0025] 前述反應（A)是與使前述脫離基L脫離氨基酸衍生物的β碳原子的反應一起實 施。
[0026] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于前述取代基R1是芳族取代基，前述步 驟（P)包含作為步驟（P-I)之對在β碳原子有取代基R 1的氨基酸衍生物，在β碳原子導 入脫離基L的步驟。
[0027] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于前述步驟（P)，包含作為步驟（Ρ-2) 之使甘氨酸與以R1CHO代表的醛化合物反應的步驟。
[0028] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于前述步驟（B)是，將結合在該氨基酸 衍生物的α碳原子的氨基變換為酰基氨基的反應，在前述步驟（II)中的D-或L-氨基酸 選擇性水解酶是D-或L-氨基酰化酶（aminoacylase)。
[0029] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在前述步驟（II)中，分離經水解的 D-或L-氨基酸衍生物的步驟，含有對經水解的D-或L-氨基酸衍生物導入脂溶性保護基的 步驟，由因脂溶性保護基的有無而產生的疏水性的差異，分離經導入脂溶性保護基的D-或 L-氨基酸衍生物的步驟。
[0030] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經保護或未經保護的硫醇 基的D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步驟（II)中，使用D-氨基酸選擇性水 解酶，隨后分離經水解的D-氨基酸衍生物。
[0031] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經保護或未經保護的硫醇 基的L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步驟（II)中，使用L-氨基酸選擇性水 解酶，隨后分離經水解的L-氨基酸衍生物。
[0032] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在前述步驟（A)中導入的硫醇基是 經從PMB (對甲氧基芐基）、Acm(乙酰氨基甲基）、芐基、Trt (三苯甲基）、二硫代、叔丁基選 出的保護基所保護的硫醇基。
[0033] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基的 經光學拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，該制造 方法含有以下步驟，
[0034] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應，而制造含有D-型及L-型，在β位有經保 護或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0035] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導入經保護或未經保護的硫醇基的反應，
[0036] 以及，
[0037] (B)將結合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，變換為要成為D-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質的取代基的反應，
[0038] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-氨基酸選擇性水解酶反應，隨后分離經 水解的D-氨基酸衍生物的步驟，
[0039] 以及，
[0040] (III)水解在（II)未經水解的L-氨基酸衍生物，隨后獲得經水解的L-氨基酸衍 生物的步驟。
[0041] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基的 經光學拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，該制造 方法包含以下的步驟，
[0042] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應，制造包含D-型及L-型之在β位有經保護 或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0043] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導入經保護或未經保護的硫醇基的反應，
[0044] 以及，
[0045] (B)將結合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，變換為要成為D-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質的取代基的反應，
[0046] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使L-氨基酸選擇性水解酶反應，隨后分離經 水解的L-氨基酸衍生物的步驟，
[0047] 以及，
[0048] (III)水解在（II)未經水解的D-氨基酸衍生物，隨后獲得經水解的D-氨基酸衍 生物的步驟。
[0049] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基之 經光學拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，
[0050] 前述步驟（B)是將在該氨基酸衍生物的α碳原子結合的氨基，變換為酰基氨基的 反應，
[0051] 在步驟（II)所述的"（I)所得的氨基酸衍生物"是包含以下的式所代表之關于α 碳原子的D-型及L-型的組合物
[0053][其中，R2代表氫原子或硫醇基的保護基，X代表經保護或未經保護的羧基，Acyl 表示酰基，R1表示構成氨基酸的側鏈的取代基中，結合在β碳原子的取代基部分（但，氫原 子的情況除外）。]，
[0054] 前述步驟（II)中，D-或L-氨基酸選擇性水解酶是D-或L-氨基酰化酶。
[0055] 此外，本發明的另外的實施實施方案，提供包含以下式所代表之關于氨基酸衍生 物的α碳原子的D-型及L-型的組合物
[0057] [其中，R2代表氫原子或硫醇基的保護基，X代表經保護或未經保護的羧基，Acyl 表示酰基，R1表示構成天然型氨基酸的側鏈的取代基中，在β碳原子結合的取代基部分 (但，氫原子的情況除外）。]。此外，這種氨基酸衍生物亦可為前述式所代表的化合物的鹽。
[0058] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 1是結合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成的群選出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氫原子）。
[0059] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 2是硫醇基的保護基。
[0060] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基X是C00H。
[0061] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 1是結合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成之群選出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氫原子），前述取代基R 2是硫醇基的保護基，前述取代基X是C00H。
[0062] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物是前述D-型及L-型的等量混合物。
[0063] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基及 取代基R1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R 1是指芳族取代基而言。]的制造方 法，而含有以下的步驟，
[0064] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的步驟，制造含有D-型及L-型，在β位有經保護 或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0065] (P-ι)對于在β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在該β碳原子導入脫離基 L，制造在β碳原子有取代基R1及脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0066] (A)由該氨基酸衍生物的β碳原子使前述脫離基L脫離，且，在該β碳原子導入 經保護或未經保護的硫醇基的步驟，
[0067]以及，
[0068] (B)將該氨基酸衍生物之α碳原子結合的氨基或羧基，變換成為D-或L-氨基酸 選擇性水解酶的基質的取代基步驟，
[0069] 以及，
[0070] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶反應，隨后分 離經水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0071] 此外，本發明的一實施實施方案中，提供在β位有經保護或未經保護的硫醇基及 取代基R 1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法[其中，R 1是指構成氨基酸的側鏈 的取代基中，結合在β碳原子的取代基部分而言（但，除氫原子的情況）。]，而含有以下的 步驟，
[0072] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的步驟，制造含有D-型及L-型之在β位有經保護 或未經保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0073] (Ρ-2)使甘氨酸與以R1CHO代表的醛化合物反應，制造在β碳原子有取代基R 1及 脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0074] (A)由該氨基酸衍生物的β碳原子使前述脫離基L脫離，且，在該β碳原子導入 經保護或未經保護的硫醇基的步驟，
[0075] 以及，
[0076] (B)將該氨基酸衍生物的α碳原子結合的氨基或羧基，變換成為D-或L-氨基酸 選擇性水解酶的基質的取代基的步驟，
[0077] 以及，
[0078] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶反應，隨后分 離經水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0079] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經保護或未經保護的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用包含關于α碳原子的D-型 及L-型的氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不對稱碳原子的氨基酸衍生物。
[0080] 此外，本發明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經保護或未經保護的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用關于α碳原子的D-體及 L-型的等量混合物之氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不