篩選方法
【專利說明】篩選方法 發明領域
[0001] 本發明涉及一種鑒定在治療癌癥中有用的化合物的篩選方法及通過本發明的方 法鑒定的化合物。
[0002] 發明背景
[0003] FoxMl是Forkhead (叉頭）家族的一種轉錄因子。它在文獻中也稱作 Trident (三齒）（在小鼠中），在人中），WIN或INS-I (在大鼠中），MPP-2(部 分人cDNA)或FKHL-16。Forkhead家族包含多種通過稱作Forkhead或翼狀螺旋域的 保守DNA結合域定義的轉錄因子。FoxMl基因是通過用簡并引物對cDNA文庫篩選具有 保守 Forkhead DNA 結合域的同源物而克隆的（W. Korver, J. Roose, H. Clevers, Nucleic Acids Res. 25(1997) 1715-1719)。揭示了 FoxMl 基因編碼一個 Forkhead 轉錄因子家族 成員，它展現DNA結合域中與五個它的最接近相關Forkhead成員（即FoxA3 (HNF-3 γ )， FoxCl (fkh-l)，FoxF2(FREAC-2)，FoxKl (ILF)和 FoxN2 (HTLF))的 45 % 同一性。發現 FoxMlC 端區與編碼稱作MPP-2的221個氨基酸的可讀框的人部分cDNA具有同源性（76%同一性）。 MPP-2代表MPM-2反應性磷蛋白-2,而且是用特異性結合以磷酸絲氨酸-脯氨酸依賴性方 式磷酸化的有絲分裂蛋白質上的表位的MPM-2單克隆抗體篩選成淋巴細胞衍生cDNA文庫 后鑒定的。FoxMl在體外經由共有位點TAAACA結合DNA。這種基序分享受到Forkhead家 族其它成員識別的核心序列。特別地，這些基序以可變取向的重復常常表現在FoxMl的選 定結合序列內。
[0004] 人FoxMl基因是一種10個外顯子的結構，跨越12pl3-3染色體帶（端粒位置）上 的大約 25kb (W. Korver, J. Roose, H. Clevers, Nucleic Ac-ids Res. 25 (1997) 1715-1719) 〇 分別稱作外顯子Va和Vila，也稱作外顯子Al (或大鼠外顯子6)和A2的兩個外顯子是可 變剪接的（H. Ye, T. F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D. G. Overdier, K. A. Roebuck, R. H. Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641)。外顯子 Va 編碼 DNA 結合域的 C 端部分內 的15個氨基酸的插入，而且在任何其它Forkhead轉錄因子家族成員中沒有看到。外顯子 Vila代表該蛋白質的C端內的38個氨基酸的插入。人FoxMl中外顯子Va和Vila的差異 剪接產生三類轉錄物，A類含有所有兩種可變外顯子，B類不含可變外顯子，而C類只保留 外顯子 Va(H. Ye, T. F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D. G. Overdier, K. A. Roebuck, R. H. Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641)。FoxMlB 和 FoxMlC 均有轉錄活性，而由于外 顯子Vila在C端反式激活域中的插入，FoxMIA無轉錄活性。FoxMIA中反式激活域的這種 破壞不僅導致轉錄失活，它可能還引起這種變體作為顯性-負面變體起作用，因為它在功 能性反式激活域缺失下保留了正常DNA結合活性（H. Ye, T. F. Kelly, U. Samadani, L. Lim, S. Rubio, D. G. Overdier, Κ· A. Roebuck, R. Η· Costa, Mol. Cell Biol. 17 (1997) 1626-1641) 〇
[0005] FoxMl在多種腫瘤類型中過表達，包括神經，胃腸，和生殖起源的那些 (Bektas et al. , supra ；Nakamura et al.,2004, Oncogene 23:2385-400 ;Pilarsky et al. , 2004, Neoplasia. Q:744-50 ；Liu et al.,2006,Cancer Res 66:3593-602)〇 FoxMl的這種表達樣式歸于FoxMl反式激活細胞周期行進需要的基因的能力（Wang et al·，2002, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:16881-6)。在人基細胞癌中發現的升高的 核FoxMlB染色提示FoxMl是人癌癥中的細胞增殖需要的（Teh et al. ,2002, Cancer Res. 62:4773-80)。然而，FoxMl在建立或推動腫瘤行進和疾病管理中的詳細作用尚未完全 闡明。
[0006] EP 2 298 896公開了抑制FoxMlB蛋白質表達的siRNA分子及該siRNA分子用于 抑制腫瘤生長的用途。
[0007] WO 2011/127297公開了用于治療乳腺癌的包含FoxMl抑制劑和Here印tin的組合 物。抑制劑為例如FoxMl特異性siRNA或噻唑抗生素諸如硫鏈絲菌肽。
[0008] 本發明要解決的問題是提供治療癌癥的新化合物。
[0009] 發明概述
[0010] 在第一個方面，本發明提供用于預防或治療癌癥的誘導FoxMl基因可變剪接的化 合物（剪接修飾劑），其中該化合物誘導無轉錄活性的FoxMl變體。
[0011] 在一個特定實施方案中，所述無轉錄活性的FoxMl變體為FoxMlA。
[0012] 在一個特定實施方案中，所述FoxMl基因為人FoxMl基因。
[0013] 在一個特定實施方案中，所述癌癥選自下組：肝，前列腺，腦，乳腺，肺，結腸，胰腺， 皮膚，宮頸，卵巢，口，血液和神經系統的癌癥。
[0014] 在一個特定實施方案中，所述用于預防或治療癌癥的FoxMl剪接修飾劑為式I的 化合物：
[0016] 其中R1選自芳基，雜芳基，雜環烷基，這三種取代基均是任選用C1 7烷基，C1 7烷氧 基，C1 7鹵代烷氧基，C i 7鹵代烷基，鹵素，羥基，氛基，NO 2取代的；
[0017] R2為C i 7烷氧基，任選用下述取代：雜環烷基，NR' R"，雜環烷基，任選用下述取代： 羥基，NR' R" -C1 7烷基，羥基-C i 7烷基，C 3 s環丙基，雜環烷基，C i 7烷氧基-C i 7烷基，羥 基-C1 7烷氧基-C i 7烷基，鹵素或氮雜螺環烷基，氮雜雙環烷基，C 2 7炔基，任選用下述取代： NR' R"，或雜芳基，任選用下述取代：C1 7烷基，
[0018] R3為鹵素，C i 7烷基，
[0019] R'和R"獨立選自氫，C1 7烷基，羥基-C1 7烷基。
[0020] 在一個特定實施方案中，所述用于預防或治療癌癥的FoxMl剪接修飾劑為式（I) 的化合物，其中R 1為芳基或雜芳基，這兩種取代基均是任選用C1 7烷基，C1 7鹵代烷基，鹵素， C1 7烷氧基，NR' R"取代的，R 2為雜芳基或雜環烷基，這兩種取代基均是任選用C1 7烷基，羥 基-C1 7烷基，鹵代-C i 7烷基取代的，R3為C i 7烷基。
[0021] 在一個特定實施方案中，本發明涉及式（I)的化合物，其中：
[0022] R1為苯基，咪唑并[1，2-a]吡嗪基，吡唑并[1，5-a]吡嗪基，咪唑并[1，2-a]吡啶 基，1，3-苯并口惡唑基，吲唑基。
[0023] 在一個特定實施方案中，所述用于預防或治療癌癥的FoxMl剪接修飾劑為式（I) 的化合物，其中R 2為哌啶基，嗎啉基，哌嗪基，吡啶基，1，2, 3, 6-四氫吡啶基，吡咯烷基。
[0024] 本發明進一步提供了本發明的化合物制備用于預防或治療癌癥的藥物的用途。
[0025] 在又一個方面，本發明提供了一種藥物配制劑，其包含本發明的化合物。
[0026] 在又一個方面，本發明提供了一種預防或治療癌癥的方法，其包括對有需要的受 試者施用有效量的本發明的化合物。
[0027] 在又一個方面，本發明提供了一種篩選用于預防或治療癌癥的化合物的方法，其 包括：
[0028] a)使增殖中的表達FoxMl基因的細胞與測試化合物接觸，
[0029] b)測量步驟a)的細胞中的FoxMl變體FoxMlA，其中與對照相比升高水平的 FoxMlA變體指示預防或治療癌癥的化合物。
[0030] 在又一個方面，本發明提供了一種篩選用于預防或治療癌癥的化合物的方法，其 包括：
[0031] a)使增殖中的表達FoxMl基因的細胞與測試化合物接觸，
[0032] b)測量步驟a)的細胞中的FoxMl變體FoxMlB和/或變體FoxMlC，其中與對照相 比降低水平的變體FoxMIB和/或變體FoxMIC指示預防或治療癌癥的化合物。
[0033] 在本發明方法的一個特定實施方案中，所述細胞為成纖維細胞。
[0034] 在本發明方法的一個特定實施方案中，在RNA水平上測量FoxMl變體。
[0035] 在本發明方法的一個特定實施方案中，在蛋白質水平上測量FoxMl變體。
[0036] 附圖簡述
[0037] 圖1。成纖維細胞中FoxMl朝向FoxMlA的可變剪接的誘導。將人成纖維細胞與不 同劑量的化合物1-4 一起溫育24小時，并通過RT-qPCR評估FoxMlA RNA (含有外顯子A2) 和FoxMlB/C(缺少外顯子A2)mRNA表達的變化。將劑量響應曲線擬合Hill結合方程以估 算 EC5。。圖 1A，FoxMlA mRNA 的上調；圖 1B，FoxMlB/C mRNA 的下調；圖 1C，FoxMlA 上調和 FoxMlB/C下調的EC5。值的相關性。數據代表4次獨立觀察的均值土SEM。
[0038] 圖2。化合物對增殖阻滯和細胞死亡的誘導。成纖維細胞中朝向FoxMIA的可變 FoxMl剪接。將人成纖維細胞與不同劑量的化合物1-4 一起溫育5天（120小時），并在線評 估細胞阻抗（細胞指數）的變化。數據表述成針對每個孔的起始值標準化后的A細胞指 數。對72,96和120小時時間點（見箭）時的數據取平均值進行量化。圖2A，漸增劑量的 化合物2下成纖維細胞的生長曲線，注意，較低的劑量明顯減緩增殖，而大于ΙμΜ的劑量對 細胞有毒；圖2Β，化合物1-4對細胞指數的劑量依賴性降低，表述成未處理對照的％。75% 處的截留（EC75%，虛線）定義為觀察到有意義的對增殖和細胞存活的影響的濃度。數據代 表4次獨立觀察的均值土 SEM。
[0039] 圖3。成纖維細胞中朝向FoxMlA的可變剪接的誘導與對細胞指數的影響有關