用于檢測人乳頭瘤病毒的遺傳標記的制作方法
【專利說明】用于檢測人乳頭瘤病毒的遺傳標記 本申請是申請號為"200980153183. 8"，申請日為"2009年10月26日"，發明名稱為"用 于檢測人乳頭瘤病毒的遺傳標記"的申請的分案申請。 相關申請
[0001] 本申請要求于2008年10月31日提交的美國臨時申請號61/197, 850的優先權和 利益。該申請的內容整體引入本文作為參考。 發明領域
[0002] 本發明涉及醫學和分子生物學領域。更具體而言，本發明涉及乳頭瘤病毒基因組 的El基因片段作為用于鑒別診斷的特異性標記的用途，其通過對照低危配對物檢測最常 見的高危HPV基因型來實現。 發明背景
[0003] 根據最近的全球估計，每年在女性中發生493, 000個子宮頸癌新病例，并且每年 274, 000個女性死于該疾病（Jacques Ferlay等人，2002, GL0B0CAN)。因為該疾病在多年期 間進展，所以估計全世界140萬女性伴隨子宮頸癌生活，并且全世界2-5倍或最高達7百萬 女性可能具有需要鑒定且治療的癌前狀況（Ferlay等人2002, GL0B0CAN ;Bosch等人2002， J Clin Pathol. 55:244-265)。有效篩選和治療策略的缺乏是與發達國家相比在發展中國 家顯著更高的子宮頸癌比率的主要原因。
[0004] 篩選努力在很大程度上依賴于巴氏涂片（Pap smear)，在20世紀四十年代開發的 實驗室測試，以檢測異常子宮頸細胞。該測試已在提供定期、高品質篩選的工業化國家中 達到巨大成功。但巴氏涂片程序是運行復雜且昂貴的，并且未能在其中健康系統和基礎設 施薄弱的發展中國家延伸至顯著比例的女性。重要的是，在一些國家中，由于文化限制，女 性不執行或不同意巴氏涂片程序。此外，存在與巴氏涂片測試相關的分析問題。巴氏涂片 不檢測子宮頸發育不良或惡化前的所有病例。對于指導醫生作出醫學建議的測試的假陰 性的目前可接受比率是約5-10%，但近期研究暗示巴氏涂片的實際比率可能高得多（Nanda K.等人，2000，Ann Intern Med. 132:810-819 ;Kulasingam S.等人，2002，JAMA. 288: 1749-1757)。巴氏涂片將約7-8%病例定義為不明意義的非典型鱗狀上皮細胞（AS⑶S)。在 另外20-30%病例中，由于炎癥細胞的存在，巴氏涂片可能不足以解釋。目前，為了克服與巴 氏涂片測試相關的缺點，正在進行更多研究以用于開發分析上更可靠的新測定用于早期檢 測女性中的子宮頸惡化前狀況。基于在子宮頸的一致HPV感染和侵襲性子宮頸癌發展之間 普遍公認的聯系的方法之一涉及病毒的檢測。 發明概述
[0005] 本發明提供了鑒別檢測高危型HPV的組合物和方法。具體地，新近鑒定的HPV基 因組片段用作標記用于高危型病毒的這種鑒別檢測。靶向這種標記片段的寡核苷酸引物和 探針組合物用于檢測臨床樣品例如尿中的高危HPV。
[0006] 具體地，本發明提供了包括關于人乳頭瘤病毒（HPV)的分離的遺傳標記的組合 物，所述遺傳標記包括由 SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97編碼的序列。可替代或另外地，本發明 提供了包括SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96或97的互補序列的組合物。在優選方面，本發明提供了包 括關于高危人乳頭瘤病毒（HPV)的分離的遺傳標記的組合物，所述遺傳標記包含由SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85 編碼的序列。
[0007] 本發明進一步提供了包括由 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15的序列編碼的寡核苷酸的組合物。可替代或另外地，本發明提供了包括SEQ ID NO :1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的互補序列的組合物。
[0008] 此外，本發明提供了包括關于人乳頭瘤病毒（HPV)的分離的遺傳標記的組合物， 所述遺傳標記包括與HPV的El基因同源的序列。在一個方面，序列包括HPV的El基因的 核苷酸 987 - 1135。在另一個方面，序列由SEQIDN0:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96 或 97 編碼。本發明包含與 HPV 的 El 基因至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或之間 的任何百分比點等同的序列。在優選實施方案中，序列與HPV的El基因至少70%等同。本 發明包含與 HPV 的 El 基因至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 100%或之間的任何百分比點同源的序列。在優選實施方案中，序列與HPV的El基因至少 70%同源。
[0009] 本發明提供了診斷患者中的人乳頭瘤病毒（HPV)感染的方法，其包括步驟：(a)從 所述患者中獲得尿樣品；和（b)檢測所述尿樣品中HPV的El基因的一個或多個序列；其中 檢測出HPV的El基因的一個或多個序列指示至少一種人乳頭瘤病毒的存在，從而診斷患者 中的HPV感染。根據這種方法，核酸是DNA或RNA。在這種方法的優選實施方案中，DNA是 經腎（transrenal)DNA。這種方法檢測包括經腎DNA的HPV DNA。可替代地，這種方法唯一 地檢測經腎DNA。
[0010] 在這種方法的特定實施方案中，檢測步驟包括選自下述的技術：雜交、聚合酶鏈反 應（PCR);嵌套引物PCR ;實時PCR ;NA雜交；環狀探針反應；單鏈構象多態性（SSCP);鏈置 換擴增（STA);和限制性片段長度多態性（RFLP)。
[0011] 檢測步驟包括聚合酶鏈反應，其使用足夠互補的引物對，以與HPV的El基因中的 序列雜交。此外，檢測步驟包括聚合酶鏈反應，其使用足夠互補的引物對，以與由SEQ ID NO :69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96或97編碼的序列雜交。可替代或另外地，檢測步驟包括聚合酶鏈反應，其使用 足夠互補的引物對，以與由SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15編碼的 序列或其互補序列雜交。
[0012] 當本文描述的方法使用基于聚合酶鏈反應（PCR)的方法檢測HPV時，聚合酶鏈反 應使用SEQ ID NO :41和42的引物對。SEQ ID NO :41和42的引物對鑒別檢測高危型HPV。 可替代地，聚合酶鏈反應使用下述由SEQ ID NOs :43和55、44和56、45和30、46和57、47和 58、48和33、49和34、50和36、51和59、52和38、53和39或54和40編碼的引物對中的至 少一個。在特定實施方案中，聚合酶鏈反應使用選自SEQ ID N0s:43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53和54的至少一個正向引物，和選自SEQIDN0s :55、56、30、57、58、33、34、35、 36、59、38、39和40的至少一個反向引物。聚合酶鏈反應進一步使用下述由SEQ ID NOs :43 和55、44和56、45和30、46和57、48和33、50和36、51和59以及52和38編碼的引物對 中的至少一個。在特定方面，聚合酶鏈反應使用選自SEQ ID N0s:43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52 和 54 的至少一個正向引物，和選自 SEQ ID N0s:55、56、30、57、58、33、35、36、59、 38和39的至少一個反向引物。
[0013] 在本發明的特定實施方案中，將多個引物對添加到在單管中包含的PCR反應中。 組PCR反應（group PCR reaction)包括 1-5、5-10、10-15、15-20、20-25個引物，或之間的任 何數目。組PCR反應用于鑒定在生物或臨床尿樣品中存在的所有可能的HPV形式。例如， 在單個PCR反應背景中，將表3、表4或表5中列出的引物應用于任何給定樣品。
[0014] 根據這種方法的特定方面，所述尿樣品中的核酸降解減少。減少核酸降解包括通 過增加的PH、增加的鹽濃度、熱滅活或通過用選自下述的化合物處理所述尿樣品來抑制核 酸酶活性：乙二胺四乙酸、鹽酸胍、異硫氰酸胍、N-月桂酰基肌氨酸和十二烷基硫酸鈉。
[0015] 這種方法的檢測步驟進一步包括基本上分離所述尿樣品中的所述核酸。分離通過 沉淀或通過使用固體吸附劑材料來執行。
[0016] 這種方法進一步包括使尿樣品過濾，以去除污染物。在一個方面，過濾去除包括超 過約1000個核苷酸的核酸。在另一個方面，過濾去除包括超過約300個核苷酸的核酸。 [0017] 另外地，這種方法進一步包括定量所述核酸的步驟。定量通過本領域已知的方法 來完成。
[0018] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與由本發明所屬領域 普通技術人員通常理解的含義相同的含義。下文描述了合適方法和材料，盡管與本文描述 的那些相似或等價的方法和材料可以用于本發明的實踐或測試中。本文提及的所有出版 物、專利申請、專利和其他參考文獻都整體引入作為參考。在沖突的情況下，以本說明書包 括定義為準。另外，材料、方法和實施例僅是舉例說明性的并且不意圖是限制性的。
[0019] 本發明的其他特點和優點由于下述詳述和權利要求將是顯而易見的。 附圖簡述
[0020] 圖1是HPV16的基因組中的可讀框（ORFs)的示意圖或圖。
[0021] 圖2是描述個別HPV基因型的PCR產物的凝膠電泳分析照片，其使用基因定位到 (mapped to) HPV的El基因的引物進行擴增。
[0022] 圖3是描述個別HPV基因型的PCR產物的凝膠電泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的單個引物對SEQ ID :41和SEQ ID :42進行擴增。
[0023] 圖4是描述對從具有子宮頸癌的患者中收集的尿DNA進行的HPV PCR測試的PCR 產物的凝膠電泳分析照片，其使用基因定位到HPV的El基因的單個引物對SEQ ID :41和 SEQ ID :42進行擴增。
[0024] 圖5是描述個別HPV基因型的PCR產物的凝膠電泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的所有高危特異性引物進行擴增（參見表4)。
[0025] 圖6是描述對從具有子宮頸癌的患者中收集的尿DNA進行的HPV PCR測試的PCR 產物的凝膠電泳分析照片，其使用在單管PCR反應中的所有高危特異性引物的混合物進行 擴增。引物基因定位到HPV的E1基因。
[0026] 圖7是描述個別HPV基因型的PCR產物的凝膠電泳分析照片，其使用基因定位到 HPV的El基因的高危特異性引物亞群（參見表5)。 詳述
[0027] 人乳頭瘤病毒（HPVs)是與皮膚和粘膜上皮的良性和惡性損害相關的趨上皮 病毒（圖1關于病毒的遺傳學圖）。在HPV感染和子宮頸癌的后續發展之間存在充分 證明的原因聯系。還存在使HPV感染與頭和頸癌、呼吸組織癌和乳腺癌相關的觀察。 (Braakhuis 等人，2〇04，J. Natl. Cancer Inst. % (I3) :998_1006;Dahlstrand 等人，2〇04， Anticancer Res.24(3b) :1829-35 ;Daling 等人，2004，Cancer 101(2) :270-80 ;Ha 等人， 2004，Crit. Rev. Oral Biol. Med. 15(4) :188-96 ;Hafkamp等人，Acta Otolaryngol. 124(4): 520-6 ;Harwood 等人，2004，Br. J. Dermatol. 150(5) :949-57 ;Rees 等人，2004，Clin. Otolaryngol. 29 (4) : 301-6 ;Widschwendter 等人，2004, J. Clin. Virol. 31 (4) : 292-7) 〇
[0028] 迄今為止已鑒定了超過100種不同類型的HPV(Antonsson，A.等人，2000， J. Virol. 74 :11636-11641 ;Chan，S. Υ·等人 1995, J. Virol. 69:3074-3083 ;de Villiers， E.M.等人2004, Virology 324:17-27)，其中40種已在肛殖感染中報道（de Villiers Ε_Μ· 2001，Papillomavirus Rep. 12:57-63 ;Villiers EM 等人，2004，Virology. Jun 20 ; 324(1) : 17-27)。基于HPV的