Stmn2基因作為綿羊免疫性狀的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于綿羊分子標記制備技術領域，具體涉及一種STMN2基因作為綿羊免疫 性狀的分子標記及其應用。本發明的分子標記克隆自STMN2基因。
【背景技術】
[0002] 在養羊業生產中，疾病嚴重威脅著羊只的健康并造成巨大的經濟損失。盡管通過 加強飼養管理和應用藥物疫苗等措施可預防疾病，但未能十分有效控制傳染病的流行，同 時大量藥物的使用會使動物機體產生耐藥性，給畜產品的安全造成隱患。
[0003] 長遠來看，從抗病力的遺傳基礎研究出發，篩選抗性基因，從分子水平開展抗病育 種，從遺傳上提高羊只對病原的抗性，增強免疫力是從根本上解決這一問題的重要途徑。抗 病育種潛在的巨大經濟效益以及某些疾病可作為研究人類疾病動物模型的誘人前景，正有 力地推動著這項工作的發展。隨著分子生物學、分子遺傳學和基因工程技術的發展，抗病育 種在綿羊的育種中已經開始發揮重要作用。
[0004] 在抗病育種中，抗病基因的尋找是關鍵。目前國內外已鑒定出的主要抗病候選基 因有以下幾個：
[0005] (1)天然抗性巨·結合蛋白 I (Natural resistance - associated macrophage protein I，Nrampl)，Nramp是一個基因家族，是目前研究較多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3個成員，現已發現有Nrampl和Nramp2。國內外學者對Nrampl基因與抗病力的相 關性進行了大量的研究，把Nrampl基因作為功能基因研究其結構與動物抗病性狀的報道 也較多，但主要集中在人類、小鼠、豬和家禽上（陳冬金，謝喜平，陳巖鋒，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研究進展.畜牧與飼料科學，2012, 33(7) : 79 - 81.)。綿羊的Nrampl基 因定位在 1 號染色體 2q41 - q42 的區域（Pitel F. E. P. Cribiu，M. Yerle，et al. Regional localization of the ovine NRAMP gene to chromosome 2q41 - q42 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet，1995, 70 (I-2) :116 ~118·)，山羊的 Nrampl 基因 定位于 2 號常染色體上長臂 ql2. 2 (Vacca G. Μ· M. Pazzola，C. Pisano，et al. Chromosomal localisation and genetic variation of the SLClIAl gene in goats(Capra hircus). Vet J，2011. 190(1) :60~65.)。研究發現，綿羊Nrampl基因多態性與傷寒沙門氏菌易感 性和抗性有關（姚菊霞，王光華，馬利青.羊主要抗病候選基因的研究進展.青海畜牧獸醫 雜志，2014, 44(5) :40~43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝桿菌、沙門氏菌等多種胞內寄生病 原菌的侵染而發揮重要的免疫功能，對畜禽機體抗病力影響較大（吳宏梅等，NRAMPl基因 研究進展及其在抗病育種中的應用.中國畜牧獸醫，2005,32(4) :26~28.)。
[0006] (2)主要組織相容性復合物（MHC)是由一群緊密連鎖的基因群組成的一個定位于 動物某對染色體的特定區域，與免疫應答和抗病性密切相關的多基因家族，在宿主的免疫 反應中對病毒、細菌、寄生蟲的控制和清除有重要作用。目前，已證實主要組織相容性復合 物與人類和家畜的多種疾病存在著密切關系。因此，近年來對MHC的研究成為家畜抗病育 種研究中的前沿部分（孫東曉，張沅.反芻家畜主組織相容性復合物的研究進展.中國畜 牧雜志，2002,38(5) :46~47.h綿羊的MHC稱為OLA(綿羊白細胞抗原），位于第20號染 色體上，具有高度的多態性和連鎖不平衡性。根據MHC抗原結構和功能的不同，可將MHC分 為class I型class II型和class III型D -般認為綿羊MHC class II的多態性和遺傳性是 為了保護機體組織對抗疾病的感染。在這個基因區域有DQ和DR兩個亞區，OLA II類分子 的DQ和DR亞區的DRB和DQB兩個基因位點所編碼的MHC在抗原免疫系統中發揮著最主要 的作用；其第2個外顯子編碼抗原的功能區（抗原結合區）具有豐富的多態性，它組成II類 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC與生產性能具有密切的聯系，但需要進一步研究才 能應用于家畜的遺傳標記。
[0007] 此外，其它有研究的與抗病力有關的基因是TLR(Toll - like receptor，Toll 樣受體）MX1 (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒（流感）抗性因子 I)、 ILl(Interleukins 1，白細胞介素 I)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，過氧化物酶體增殖激活受體γ)等基因 D
[0008] STMN2 (stathmin - like 2)蛋白，又稱SCG10,是一種神經特異性蛋白，屬于 stathmin家族，這個家族成員包括stathmin，STMN1，STMN2, SCLIP，RB3。在胚胎期神 經元發生的過程中生長錐部位表達含量很高（Grenningloh G，Soehrman S，Bondallaz P，et al. Role of the microtubule destabilizing proteins SCGlO and stathmin in neuronal growth. J Neurobiol，2004, 58(1) :60 ~69)，出生之后突然降低，但在成熟大 腦的神經元突觸重塑部位仍有表達，這提示STMN2與神經結構重塑有著某種聯系（Mori N j Morii H. SCGlO - related neuronal growth - associated proteins in neural dev elopment, plasticity, degeneration,and aging. J Neurosci Res，2002,70 (3):264 ~ 273)，Riedrer等研究表明STMN2的過度表達能促進神經的延伸（Riedrer Beat M，Pellier Yef Ronique，Antonsson Bruno,et al. Regulation of microtubule dynamics by the neuronal growth - associated protein SCG10. Neurobiology Proc Natl Acad Sci USA，1997, 94⑵：741~745)，從而導致突觸的重塑，影響神經系統的可塑性（Hiroshi Morii，Tomiko YamadajItsuko Nakanoj et al. Site -specific phosphorylation of SCGlO in neuronal plasticity:Role of Ser73phosphorylation by N-methyld-aspartic acid receptor activation in rat hippocampus. Neuroscience Letters，2006,396 (3):241 ~ 246)。有研究發現，動物癲癇模型中STMN2的表達增高（Mori N，Morii H. SCGlO-related neuronal growth - associated proteins in neural development, plasticity, degen eration，and aging. J Neurosci Res，2002, 70 (3) : 264 ~273)，這表明其可能參與了難 治性癲癇的形成此外，有研究表明STMN2的激活與MPK(Mitogen actived protein kinase, MAPK)有關(Antonsson Bj Lutjens R，Di Paolo G，et al.Purification, char acterization，and in vitro phosphorylation of the neuron - specificmembrane -associated protein SCGlO.Protein Exp Purif，1997,9(3) :363 ~371)，而 MPK 信 號轉導途徑又廣泛參與了神經系統多種疾病的病理過程。另外，最新研究報道指出， STMN2基因還參與腫瘤的發生等病理過程（Guo Q，Su N，Zhang J，et al. PAMkinase-mediated SCGIOphosphorylation involved in gastric cancer metastasis. Oncogene, 2014, 33 (25) : 3277 - 87) 〇
[0009] 通過以上資料我們可以得出STMN2基因參與動物神經系統疾病和腫瘤等的發生 和免疫調控。尋找基因中的變異位點，通過與性狀間的關聯分析發現基因與性狀間的關系 是研究基因功能的一個重要手段，也是進行標記輔助選擇的基礎。為此開展了綿羊STMN2 基因完整cDNA序列的克隆和SNP篩查、檢測及與免疫性狀關聯分析。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于克隆綿羊STMN2基因的完整CDNA序列，尋找STMN2基因的突變 位點以及基因的多態性的檢測方法，提供適用于綿羊免疫性狀的分子標記及在關聯分析中 的應用。
[0011] 本發明通過以下技術方案實現：
[0012] 從綿羊STMN2基因片段中克隆得到一種作為綿羊標記輔助選擇的與免疫性狀相 關的分子標記，它的完整cDNA序列如序列表SEQ ID NO :1和圖1所示，它的部分DNA序列 如序列表SEQ ID NO: 2和圖2所示。在SEQ ID NO :2所示序列的第215位堿基處有一個G/ A堿基突變，該突變位于第4外顯子內，該突變導致Tfi I - RFLP多態性。
[0013] 申請人設計了一對克隆綿羊STMN2基因完整cDNA的引物序列，該引物擴增的部分 cDNA序列如SEQ ID NO :1所述。同時申請人設計了一對包含第4外顯子的用于擴增綿羊 STMN2基因組序列的引物，該引物擴增的序列如SEQ ID NO : 2所述。
[0014] 申請人提供了一種篩選上述分子標記的方法，所述的方法包括以下步驟：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、脾臟、腎臟等組織總RNA為模板，進行RT - PCR擴增、PCR產物純 化和克隆測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO :1所述cDNA序列；從綿羊血液基因 組中提取DNA，設計引物，PCR擴增、PCR產物純化、克隆和測序，獲得如序列表SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列。
[0016] 應用常規的PCR -RFLP的方法對序列表SEQ ID NO :2的第215位堿基突變進行了 檢測，并初步進行其基因型與綿羊免疫性狀之間的關聯分析的應用，為綿羊的分子標記輔 助選擇提供了 一個新的分子標記。
【附圖說明】
[0017] 序列表SEQ ID NO :1是本發明克隆的綿羊免疫性狀相關基因 STMN2的完整cDNA 序列。序列長度為769bp。
[0018] 序列表SEQ ID NO :2是本發明克隆的綿羊免疫性狀相關基因