一種基于qPCR分析雞胚BMPs基因表達譜的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種采用定量PCR技術分析雞胚早期發育階 段骨形態發生蛋白家族BMPs (bone morphogenetic protein)表達譜的方法。
【背景技術】
[0002] 由于雞胚發育周期短、易于實驗操作等特點，其胚胎對于基因功能的研究有著無 法取代的優點。所以，長期以來雞胚成為研究胚胎發育和器官形成機制的最佳模型。另外， 胚胎期是動物生長發育的關鍵時期，這時機體生長發育的狀況對動物出生后的各項性能產 生極其重要的影響。所以，研究雞胚早期關鍵基因的表達譜對于建立動物胚胎發育模型、器 官形成機制以及構建動物疾病模型，選育優良性狀都有非常重要的意義。
[0003] 雞胚胎發育過程受多種基因嚴格調控，這樣才能保證胚胎有序地進行組織分化和 個體發育。對于保證組織分化和個體發育的基因，技術上值得給予重點關注。骨形態發生 蛋白BMPs是一類具有復合功能的生長因子，屬于轉化生長因子β (transforming growth factor-β )超家族中最大的亞家族，最早是從骨提取物分離獲得的，目前已有20多個成 員，由早期胚胎外胚層釋放起即起作用，對生殖細胞的發育和功能發揮起著重要作用。
[0004] 目前，BMP2、BMP4和BMP7是研究較多的3個基因，研究對象主要集中在人和小鼠， 在雞上盡管有部分研究，但主要是對BMPs基因多態性等方面的研究，尚未見雞胚BMPs基因 表達譜方面的相關報道。BMP2是BMPs家族中活性最高的成員之一，不僅具有促進軟骨和骨 組織形成的作用，而且證實對骨組織、腦組織和脊髓組織的生長、發育、分化有重要的調節 作用，并參與細胞凋亡和細胞信號轉導的調節。BMP4參與機體的細胞生長、分化、凋亡、迀移 及細胞外基質形成等眾多病理、生理活動的調控。BMP7是成骨能力最強的亞型之一，能誘導 祖細胞分化為成骨細胞，不僅在胚胎期對腎臟發育起著重要的作用，而且在出生后對于維 持腎臟正常的生理功能及腎臟的病理生理變化等方面都有重要作用。
【發明內容】
[0005] qPCR技術特異性強、靈敏度高、操作簡單快速、安全等特點已被廣大科研工作者接 受。借助于此項技術分析包含BMP2、BMP4和BMP7的雞胚發育早期BMPs基因表達譜，不僅 有助于研究雞胚發育早期基因調控的特點，而且對于研究BMPs基因的功能和結構無疑開 辟了 一條新途徑。
[0006] 本發明要求保護一種基于qPCR分析雞胚BMPs基因表達譜的方法，包括以下步 驟： 選擇雞種，設計雞胚提取取樣方案；參考GenBank上相關基因序列設計跨內含子引物， 進行總RNA提取，合成cDNA ;在熒光定量PCR儀上，對關心的雞胚的基因表達水平進行相對 定量表達分析；設計PCR反應體系；進行PCR反應程序，選擇作為內參的基因 β-actin，計 算關心的雞胚基因的mRNA相對表達水平；用軟件統計分析基因表達量數據，分析平均數間 的差異顯著性，得出分析結果，給出報告。
[0007] 前述基于qPCR分析雞胚BMPs基因表達譜的方法，其特征在于： 所述設計雞胚取樣方案，具體是取新鮮質量相近的愛撥益加肉雞種蛋，用37°C溫水清 洗，75%酒精棉球消毒；孵化條件為溫度37. 5°C、相對濕度55%~65%、2 hr翻蛋一次；分別 用消毒的眼科剪和藥勺采集孵化1~6天的El~E6整胚，液氨速凍后-80°C冰箱保存。
[0008] 所述進行總RNA提取，是采用TRIZOL (Invitrogen)試劑，cDNA合成用M-MLV RT (Invitrogen)試劑盒進行，以cDNA第一鏈作為表達譜分析的模板，參考GenBank上雞 BMP2、BMP4、BMP7和β -actin基因序列設計跨內含子引物，以β -actin作為內參，所利用 qPCR引物如表1。
[0009] 所述相對定量表達分析，是使用SYBR Green I (Takara)在LightCycler 480定 量PCR儀上，對BMP2、BMP4和BMP7基因的表達水平進行相對定量表達分析。
[0010] 所述設計PCR反應體系具體為，SYBR>re?ix及7?, 2 X試劑10 μ L，上下游引 物各0. 2 μ L，稀釋10倍的cDNA 1 μ L，滅菌超純水加到20 μ L。
[0011] 所述PCR反應程序的進行方式具體為，95°C 5 min ;95°C 20 sec，退火溫度下20 SeC，72°C I sec，共40個循環，每個循環后采集熒光生成擴增曲線。為了分析實時熒光定 量PCR擴增的特異性和觀察是否存在引物二聚體或非特異性產物等的干擾，從而進一步證 實骨形態發生蛋白基因表達譜檢測的準確性，在上述qPCR擴增結束后，進行一個分析熔解 曲線的反應。具體地，所述恪解曲線的反應條件如下：95°C I min; (T+2) °C continue (T 代表退火溫度，見表1)，95°C 30 s，共I個循環。對所有樣本進行3個重復檢測，并在每次 試驗時設陰性對照。
[0012] 用SAS軟件統計分析基因表達量數據，用單因子方差分析分析平均數間的差異顯 著性，試驗數據以平均值土標準誤表示。
[0013] 本發明利用qPCR技術分析雞胚早期不同發育階段BMPs基因的表達水平，用以研 究BMPs基因在雞胚早期不同發育階段表達水平的變化，以便能較好地分析雞胚發育規律， 建立動物發育模型，為進一步研究動物胚胎發育和人類疾病防治提供基礎資料。
[0014] 本發明通過采集不同發育時期的整胚雞胚為試驗材料，采用TRIZOL試劑提取總 RNA，然后反轉錄合成cDNA，設計特異的雞骨形態發生蛋白基因以及內參基因 β-actin的 mRNA跨內含子qPCR表達引物，縮短了 qPCR擴增產物的長度，提高了雞骨形態發生蛋白基 因表達譜的分析效率，降低了非特異性條帶的產生，從而提高了骨形態發生蛋白基因表達 譜分析的準確性。此外，本發明使用無污染、無毒性的SYBR Green I染料，在LightCycler 480定量PCR儀上進行qPCR擴增，具有操作簡單、靈敏度高、毒害性風險低的優點。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明實施例提供的BMP2基因的qPCR擴增曲線圖； 圖2是本發明實施例提供的BMP2基因的qPCR熔解曲線圖； 圖3是本發明實施例提供的BMP4基因的qPCR擴增曲線圖； 圖4是本發明實施例提供的BMP4基因的qPCR熔解曲線圖； 圖5是本發明實施例提供的BMP7基因的qPCR擴增曲線圖； 圖6是本發明實施例提供的BMP7基因的qPCR熔解曲線圖； 圖7是本發明的分析得到的BMP2基因的E1-E6表達譜圖； 圖8是本發明的分析得到的BMP4基因的E1-E6表達譜圖； 圖9是本發明的分析得到的BMP7基因的E1-E6表達譜圖。
【具體實施方式】
[0016] 總體試驗設計：新鮮質量相近的愛撥益加肉雞種蛋，用37°C溫水清