一種人結腸癌蛋白質標志物Spondin-2的檢測方法及其檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程和醫學檢測領域，涉及一種用作人結腸癌標志物的分泌蛋白 Spondin-2的檢測方法、檢測試劑盒及其應用方法。
【背景技術】
[0002] 結腸癌在世界范圍內是第三大男性腫瘤和第二大女性腫瘤。根據世界衛生組織 GL0B0CAN2012的統計，在2012年預計有74. 6萬男性和61. 4萬女性病人，整體致死率是 50. 1% (男性）和52. 1% (女性），表明預后生存很差。腫瘤發生不但影響個人家庭，也 帶來嚴重的社會影響、增加公共衛生支出和財政負擔。因此，爭取早發現、早確證、早治療， 對于提高結腸癌的治愈率和延長預后生存時間具有非常重要的意義。結腸癌的初發階段 一般癥狀不明顯，容易被忽略，而一旦確證后則往往處于中晚期而使治療效果不佳，更影響 手術后的生存。所以，治療結腸癌或其他癌癥的一個關鍵在于盡可能早地發現結腸癌。一 般結腸癌的診斷，包括觀察排便習慣的改變、便血、腹痛等，直腸指癥，實驗室檢查包括血常 規、尿常規和大便常規、大便潛血試驗，影像檢查、B超、CT掃描、結腸鏡檢查等等。而血清 血液檢查則是最為通行、常規的檢查，常用標志物為癌胚抗原（CEA)、結直腸癌抗原（CCA)、 CA19-9,但是這些抗原檢測的臨床效果差異比較大，且檢測的靈敏度和特異性有待提高。從 這個意義上說，發現新的同時具有高靈敏度、高特異性的血液標志物是一件非常緊迫的任 務。利用這樣的新型標志物，就可以在常規體檢篩查中盡早地發現早期結腸癌的存在。
[0003] 其次，對于手術后或放化療后病人的預后效果、生存情況的預測，常規方法有賴于 病理參數、?M分期、Dukes分期等方法，但在病理判斷上有時有人為因素干擾，非常需要有 差異顯著、靈敏度高、特異性好、操作方便的分子標志物來作為輔助判斷手段，因此，尋找結 腸癌的有效標志物，準確判斷肺腺癌的臨床分期和預后成為廣大醫學研究者的迫切任務。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種人結腸癌蛋白質標志物Spondin-2的應用方法。
[0005] 本發明的另一個目的是提供人結腸癌蛋白質標志物Spondin-2的檢測方法及其 檢測試劑盒。
[0006] 本發明中，SP0N2即Spondin-2。根據本發明的研究結果，定量PCR、酶聯免疫分 析和組織免疫雜交進一步證明，Spondin-2在結腸癌組織中的表達量顯著高于在正常結 腸組織的表達量。并且，Spondin-2的高表達將縮短結腸癌患者手術后的生存期。因此， Spondin-2可以作為一種新的人結腸癌標志物和篩選檢測、治療抗結腸癌藥物的靶標為有 效判斷結腸癌癌變進程提供科學依據。本發明在此基礎上完成。
[0007] 本發明提供了一種人結腸癌標志物Spondin-2的檢測方法，包括步驟：
[0008] 分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；
[0009] 和 / 或，
[0010] 檢測所得的基因組DNA或者蛋白中Spondin-2的含量。
[0011] 所述的樣本為離體的人源的組織或者體液。
[0012] 利用Spondin-2的特異性引物擴增樣本中的基因組DNA，檢測Spondin-2的DNA含 量。在本發明的一個優選實施例中，利用序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的特異 性引物擴增樣本DNA，以便確定樣本DNA中Spondin-2的存在和含量。
[0013] 利用Spondin-2的抗體與樣本中的蛋白進行反應，檢測Spondin-2的蛋白表達量。 例如，在本發明的一個優選實施例中，采用western blot技術確定樣本中Spondin-2蛋白 的存在和含量。
[0014] 相應的，本發明還提供了人結腸癌標志物Spondin-2的檢測試劑盒，它包括特異 性擴增Spondin-2的引物，或者針對Spondin-2蛋白的抗體。
[0015] 例如，所述的特異性擴增Spondin-2的引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示。
[0016] 較好的，該試劑盒中還包括Spondin-2的標準品、緩沖試劑、說明書等。
[0017] 本發明的人結腸癌蛋白質標志物檢測試劑盒可以用于制備診斷、預測、檢測或篩 查人結腸癌癌細胞擴散、結腸癌淋已結轉移、結腸癌臨床分期和結腸癌患者預后，等等。
[0018] 另一方面，本發明提供了人結腸癌標志物Spondin-2的應用方法，即Spondin-2在 制備診斷或預測結腸癌轉移、結腸癌臨床分期、結腸癌患者預后的制劑中的應用。
[0019] 例如，所述的標志物Spondin-2在制備診斷或預測結腸癌轉移、結腸癌臨床分期、 結腸癌患者預后的試劑盒中的應用。所述的標志物Spondin-2在制備診斷、緩解或治療結 腸癌藥劑中的應用。Spondin-2可以作為篩選制備診斷、緩解或治療結腸癌藥劑的靶標。
[0020] 本發明提供了一個用于區分人結腸癌組織以及癌旁正常結腸組織、無淋巴結轉移 結腸癌組織和有淋巴結轉移結腸癌組織的質膜蛋白標志物Spondin-2,以及利用該標志物 制備判斷人結腸癌、結腸癌擴散，結腸癌淋巴結轉移、臨床分期、結腸癌患者預后和預后的 制劑和試劑盒。本發明為有效判斷人結腸癌癌變進程提供科學依據。本發明的檢測試劑盒 高效、靈敏、特異性強，相關的檢測方法快速、簡便，成本較低。
【附圖說明】
[0021] 圖1是利用Oncomine公共數據庫中的基因表達芯片數據分析Spondin-2基因 在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達。圖I-A是利用Gaedcke Colorectal數據分析 Spondin-2在65對直腸和直腸癌組織中的表達的散點圖，散點下的數字表示病例或正常樣 本的個數，P值為用Student t teSt(T檢驗）分析得到的顯著性值，星號代表該T檢驗用 的是配對T檢驗。圖I-B是利用Graudens Colon數據分析Spondin-2在12例結腸和48 例結腸癌組織中的表達的散點圖。圖I-C是利用Hong Colorectal數據分析Spondin-2在 12例結腸和48例結腸癌組織中的表達的散點圖。圖I-D是利用Skrzypczak Colorectal 數據分析Spondin-2在24例結腸和81例結腸癌組織中的表達的散點圖。圖I-E是利用Ki Colon數據分析Spondin-2在28例結腸和82例結腸癌組織中的表達的散點圖。圖I-F是 利用Skrzypczak Colorectal 2數據分析Spondin-2在20例結腸、10例結腸腺瘤和10例 結腸癌組織中的表達的散點圖。圖I-G是利用TCGAColorectal數據分析Spondin-2在22 例結直腸組織和101例結腸腺癌、60例結腸癌、22例結腸粘液腺癌和22例盲腸腺癌組織中 的表達的散點圖。圖I-H是利用Kaiser Colon數據分析Spondin-2在12例結腸和41例 結腸腺癌、13例結腸粘液腺癌、17例盲腸腺癌、8例乙狀直腸腺癌和4例直腸粘液腺癌組織 中表達的散點圖。
[0022] 圖2是分析Spondin-2的mRNA和蛋白質在結直腸癌細胞系和組織中的表達。圖 2- A是用定量PCR的方法分析Spondin-2基因在10對結直腸癌組織中的表達水平。p值為 用Student t test (T檢驗）分析得到的顯著性值。圖2-B是用Western blot方法分析 Spondin-2蛋白在結腸癌細胞系的表達水平。圖2-C是Spondin-2蛋白在結腸癌和癌旁組 織的表達統計，利用一個商業化組織芯片（含90例癌和癌旁組織）進行Spondin-2的免疫 組織化學分析。圖2-D是Spondin-2蛋白在結腸癌和癌旁組織的表達統計，利用另一個商 業化組織芯片（含90例癌和癌旁組織）進行Spondin-2的免疫組織化學分析。η代表進入 分析的有效例數。SP0N2 代表 Spondin-2。GAPDH 代表 dehyde phosphate dehydrogenase 即磷酸甘油酸脫氫酶，作為內標。縱坐標Optical density value是光密度值，指用軟件掃 描組織化學染色圖片獲得的染色深淺值。值的大小反映蛋白表達高低，值大則表達高，值小 則表達低。
[0023] 圖3是利用商業化組織芯片進行Spondin-2免疫組織化學分析的結果。圖3-A是 展示Spondin-2陰性表達的結腸組織。圖3-B是Spondin-2陽性表達的癌旁結腸組織。圖 3- C是Spondin-2陰性表達的結腸癌組織。圖3-D是Spondin-2低陽性表達的結腸癌組織。 圖3-E是Spondin-2中陽性表達的結腸癌組織。圖3-F是Spondin-2高陽性表達的結腸癌 組織。
[0024] 圖4是Kaplan-Meier曲線分析Spondin-2的基因和蛋白表達與結腸癌生存的關 系圖。圖4-A是Spondin-2基因表達與結腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖。 基因表達數據來源于Oncomine基因表達公共數據庫。圖4-B是Spondin-2基因表達與結 腸癌病人無病生存的Kaplan-Meier曲線分析圖。基因表達數據來源于Oncomine基因表達 公共數據庫。圖4-C是Spondin-2蛋白表達與結腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線 分析圖。SP0N2 代表 Spondin-2。
[0025] 圖5是用ELISA的方法檢測結腸癌病人和正常人血漿中的Spondin-2蛋白表達。 圖5-A是ELISA分析結腸癌病人和正常人血漿中的Spondin-2蛋白表達，根據標準品的量 測定Spondin-2在病人和正常人血楽中的量，p值為用Student t test (T檢驗）分析得到 的顯著性值。N代表病例數。圖5-B是Spondin-2蛋白血漿表達的受試者操作特性（ROC) 曲線分析。橫坐標代表假陽性或1-特異性，縱坐標代表真陽性或靈敏度。對角線是參考線。 AUC代表線下面積。SP0N2代表Spondin-2。
【具體實施方式】
[0026] 本發明的人結腸癌蛋白質標志物Spondin-2可以用于制備診斷、預測、檢測或篩 查人結腸癌癌細胞擴散、結腸癌淋巴結轉移、結腸癌臨床分期、結腸癌患者預后的制劑。人 結腸癌蛋白質標志物Spondin-2可以用于制備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌的制劑；特 別是用于制備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌的試劑盒。下面結合優選實施例對本發明作 詳細說明，而不會限制本發明。
[0027] 實施例1利用生物信息學方法分析Spondin-2基因在結腸癌和癌旁組織中的表達
[0028] 利用 Oncomine 公共數據庫（https://www. oncomine. org/resource/login. html) 分析Spondin-2基因在結腸癌和癌旁組織中的表達。分析方法：登錄上述Oncomine數 據庫，輸入SP0N2基因名，腫瘤類型選擇結腸癌，數據類型選擇mRNA，差異分析類型選擇 癌和正常分析，繼而分析Spondin-2基因在各個數據集中的表達情況，將各個數據集中 Spondin-2基因在癌和癌旁表達值分別下載、另行分析其表達的差異是否顯著。經過分析， 證明Spondin-2基因在癌組織中相比于癌旁組織呈現顯著高表達趨勢，這被多個數據集的 分析所證明，包括 Gaedcke Colorectal (圖