格氏乳球菌細菌素及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種格氏乳球菌細菌素及其制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 細菌素是某些細菌通過核糖體合成機制產生的分泌到環境中的一類具有抑菌活 性的蛋白或多肽。細菌素與抗生素的根本差別是大部分細菌素只對近緣關系的細菌有損害 作用，而且無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，同時也不污染環境。因此細菌素可以部分減 少甚至取代抗生素的使用。細菌素由于無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，并可以抑制或殺 死一些食物腐敗菌，具有一定的熱穩定性，易被人體消化道的部分蛋白酶降解，因此不會在 體內積蓄引起不良反應，也不會影響抗生素的活性，在食品中易擴散，使用較方便，同時也 不污染環境，因而受到食品、醫療、飼料等行業的青睞。
[0003] 細菌素的產量除了與菌株自身性質有關外，發酵條件對細菌素的產量有很大影 響，如培養基成分、有機溶劑、培養溫度、培養時間、培養方式、起始P H值、接種量和接種種 齡等，其中以培養基成分、有機溶劑和培養溫度影響較大。
[0004] 目前只有Nisin和pediocinPA-l/Ac H在工業中有應用，但由于這些細菌素只對 大多數革蘭氏陽性細菌有抑制作用，但對革蘭氏陰性細菌無作用，而且在酸性環境下不穩 定，這使得目前乳酸菌細菌的應用范圍較窄，限制了其在食品中的應用。因此開發新型廣 譜、抗菌活性強，穩定性強的乳酸菌細菌素已成為目前的發展趨勢。
【發明內容】
[0005] 基于此，本發明的目的之一在于提供一種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細 菌素的制備方法，該細菌素由格氏乳球菌（Lactococcus garviea)的發酵培養液提取得到。
[0006] 實現上述發明目的具體技術方案如下：
[0007] -種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素的制備方法，所述格氏乳球 菌（Lactococcus garviea)細菌素由保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015633的格氏乳球菌 (Lactococcus garviea)的發酵液提取得到，包括以下步驟：
[0008] (1)格氏乳球菌的活化：將格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在營養肉湯中活 化；
[0009] (2)格氏乳球菌的發酵培養：將活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)接 種于培養基中進行發酵培養，得發酵液；
[0010] ⑶細菌素的提取：調節步驟⑵得到的發酵液的PH值為8. 8~9. 6,放置Ih~ 4h后離心，收集菌體；將菌體懸浮于蒸餾水中，調節pH為4. 7~6. 5,振蕩Ih~4h后離心， 收集上清液；將上清液濃縮，冷凍干燥，即得到所述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細 菌素。
[0011] 在其中一些實施例中，步驟（2)所述培養基為改良的M17培養基，其成分為：L-阿 拉伯糖0.1 g~5g，植物蛋白胨5g~10g，酵母粉5g~10g，聚蛋白胨3g~7g，抗壞血 酸 0· 3g ~0· 7g，牛肉膏 1.0 g ~2. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 005g ~0· 015g，β -甘油磷酸二鈉 5g_15g，蒸饋水 1000mL。
[0012] 在其中一些實施例中，步驟（2)所述改良的M17培養基的成分為：L-阿拉伯糖 0. lg，植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗壞血酸0. 5g，牛肉膏1.5g，MgS04· 7H20 0. 01g，β -甘油磷酸二鈉10g，蒸餾水1000mL。
[0013] 在其中一些實施例中，步驟（1)所述活化的時間為12h~48h，活化的溫度為 32°C~45°C，活化的轉速為IOOrpm~280rpm。
[0014] 在其中一些實施例中，步驟（2)將活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea) 按體積比為0. 5%~10. 0%的接種量接種于培養基中進行發酵培養，發酵培養的時間為 12h ~144h，溫度為 25°C~45°C，轉速為 IOOrpm ~280rpm。
[0015] 在其中一些實施例中，步驟（2)將活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea) 按體積比為10. 0%的接種量接種于培養基中進行發酵培養，發酵培養的時間為144h，溫度 為32°C，轉速為240rpm。
[0016] 在其中一些實施例中，步驟（3)的細菌素的提取方法為：調節步驟（2)得到的發酵 液的pH值為8. 8,4°C下放置Ih后離心，收集菌體；將菌體懸浮于蒸餾水中，調節pH為4. 7， 在4°C下振蕩Ih后離心，收集上清液；將上清液濃縮至原體積的1/2,冷凍干燥，即得到所述 格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素。
[0017] 本發明的另一目的在于提供一種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素。
[0018] 具體技術方案如下：
[0019] -種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素，由上述制備方法制備而得。
[0020] 本發明的另一目的在于提供上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素的應 用。
[0021] 具體技術方案如下：
[0022] 上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素在制備細菌抑制劑、真菌抑制劑 以及生物防腐劑中的應用，所述細菌為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌，所述真菌為酵母、霉 菌。
[0023] 上述格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素在制備防治急性腸炎或慢性腸炎 的藥物中的應用。
[0024] 本發明的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)已于2015年10月22號保藏于武漢 大學保藏中心中國典型培養物保藏中心（CCTCC，地址：武漢市武昌珞珈山），保存期為三十 年，保藏編號CCTCC M 2015633。
[0025] 本發明篩選得到一種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，其保藏編號為CCTCC M 2015633,對該格氏乳球菌（Lactococcus garviea)的發酵液進行提取可獲得抑菌范圍 廣的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素。本發明用含阿拉伯糖的培養基來誘導 培養格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，再對其培養發酵液通過pH吸附法進行細菌素 的提取，可獲得高產量的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素，IL發酵液可制備 800mg以上的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素。該格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素具有很強的廣譜抑菌能力，對引起人類疾病以及食物腐敗的一些革 蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母和霉菌均有很強的抑制作用。本發明的格氏乳球菌 (Lactococcus garviea)細菌素具有治療與預防急慢性腸炎的作用。本發明制備的格氏乳 球菌（Lactococcus garviea)細菌素還可以用于制備食品、醫藥、化妝品、飼料等行業防腐 劑。
【具體實施方式】
[0026] 以下將結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0027] 以下實施例中，未注明具體條件的實驗方法，按本領域內常規方法和條件進行。 格式乳球菌（Lactococcus garviea)保藏在武漢大學保藏中心中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏編號CCTCC M2015633。
[0028] 實施例1
[0029] 本實施例的一種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素的制備方法，包括以 下步驟：
[0030] (1)格式乳球菌的活化：將格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在營養肉湯中活 化48h，活化溫度為32°C，轉速為240rpm ;
[0031] (2)格式乳球菌的發酵培養：活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)按 10% (v/v)的接種量接種于改良的M17培養基中，發酵培養144h，培養溫度為32°C，轉速為 lOOrpm，得到發酵液；所述改良的M17培養基的成分為：L-阿拉伯糖0. lg，植物蛋白胨5g， 酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗壞血酸0· 5g，牛肉膏I. 5g，MgSO4 · 7H20 0· Olg，β -甘油磷酸二 鈉 l〇g，蒸餾水1000 mL ;
[0032] (3)細菌素的提取：調節步驟⑵得到的發酵液的pH值為8. 8,4°C下放置lh，使 格氏乳球菌（Lactococcus garviea)充分吸附細菌素；在8000rpm下離心5min，收集菌體； 將菌體懸浮于蒸餾水中，調節pH為4. 7,在4°C下振蕩lh，在8000rpm下離心5min收集上 清液；將上清液旋轉蒸發濃縮至原體積的1/2后冷凍干燥，得到格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素 837mg〇
[0033] 實施例2
[0034] 本實施例的一種格氏乳球菌（Lactococcus garviea)細菌素的制備方法，包括以 下步驟：
[0035] (1)格式乳球菌的活化：將格氏乳球菌（Lactococcus garviea)在營養肉湯中活 化12h，活化溫度為37°C，轉速為240rpm ;
[0036] (2)格式乳球菌的發酵培養：活化后的格氏乳球菌（Lactococcus garviea)按 0. 5% (v/v)的接種量接種于改良的M17培養基中，發酵培養12h，培養溫度為37°C，轉速為 lOOrpm，得到發酵液；所述改良的M17培養基的成分為：L-阿拉伯糖5g，植物蛋白胨10g，酵 母粉l〇g，聚蛋白胨5g，抗壞血酸0· 5g，牛肉膏L 5g，MgS04 · 7H20 0· 01g，β -甘油磷酸二鈉 l〇g，蒸餾水 l〇〇〇mL ;
[0037] (3)細菌素的提取：調節步驟⑵得到