用于為核酸擴增作對照的寡核苷酸的制作方法
【專利說明】用于為核酸擴增作對照的寡核苷酸 發明領域
[0001] 本發明屬于體外診斷學的領域。在此領域內，它特別關注用于定性和/或定量目 的擴增和檢測對照核酸。
【背景技術】
[0002] 在分子診斷學領域中，從許多來源中擴增核酸已經具有相當大的意義。用于核酸 擴增和檢測的診斷應用的例子是病毒（如人類乳頭狀瘤病毒（HPV)、西尼羅河病毒（WNV)) 的檢測，或針對人類免疫缺陷病毒（HIV)、乙肝病毒（HBV)和/或丙肝病毒（HCV)存在的獻 血常規篩查。此外，所述擴增技術適用于細菌目標（如分枝桿菌（mycobacteria))，或腫瘤 學標志物的分析。
[0003] 最突出和廣泛使用的擴增技術是聚合酶鏈式反應（PCR)。其它擴增反應特別包括 連接酶鏈式反應、聚合酶連接酶鏈式反應、缺口 -LCR，修復鏈式反應、3SR、NASBA、鏈置換擴 增（SDA)、轉錄介導的擴增（TM)以及Qi3 -擴增。
[0004] 用于基于PCR的分析的自動化系統經常利用在PCR過程期間在同一反應容器中的 產物擴增的實時檢測。這種方法的關鍵在于使用攜帶報告基團或標記物的經修飾的寡核苷 酸。
[0005] 已經表明在同一容器中擴增和檢測超過一種目標核酸是可能的。此方法通常稱作 "多重（multiplex) "擴增，并且如果進行實時檢測，那么需要用于區分的不同標記物。
[0006] 出于定性（性能（performance)對照）和/或定量（使用對照作為參考確定目標 核酸的量）的目的，使用具有已知序列的對照核酸來為相應的擴增作對照在臨床核酸診斷 學領域中通常是期望的或者甚至是強制性的。考慮到特別是診斷目標（包括原核、真核以 及病毒核酸）的多樣性，以及考慮到不同類型核酸（如RNA和DNA)之間的多樣性，通常以 特定方式設計對照核酸。
[0007] EP 2759604公開了一種用于檢測一組非競爭性內部對照核酸（non-competitive internal control nucleic acid)的方法。
[0008] 本文中所描述的是用于此目的的經改善的寡核苷酸和方法。
【發明內容】
[0009] 本文中所描述的第一方面是具有SEQ ID NO 1的序列的分離的寡核苷酸（an isolated oligonucleotide with the sequence of SEQ ID NO 1)。此寡核苷酸可以作為 探針使用以實現對包括SEQ ID NO 4的序列的對照核酸的改善的檢測。
[0010] 因此，本文中描述的另一方面是具有SEQ ID NO 1的探針用于檢測包括SEQ ID NO 4的對照核酸的用途。
[0011] SEQ ID NO 4的序列是一種雜混序列（scrambled sequence)，其不與任何天然存 在的序列顯示任何顯著的同源性，使得它可以充當非競爭性內部對照核酸序列以定性和/ 或定量檢測多個目標核酸，如EP 2759604中所述的。
[0012] 在核酸擴增測定法（例如PCR測定法，如實時PCR測定法）中，可以用包括具有 SEQ ID NO 2的第一引物和具有SEQ ID NO 3的第二引物的特異性引物組有效擴增SEQ ID NO 4〇
[0013] 因此，本文中所描述的一個方面是包括具有SEQ ID NO 1、2和3的寡核苷酸的組 合物。
[0014] 這些核酸可以以套組（kit-of-parts)提供給技術人員，所述套組還包括適當的 擴增和檢測目標，即具有SEQ ID NO 4的序列的對照核酸。
[0015] 因此，本文中所描述的另一方面是用于為多個目標核酸的檢測作對照的試劑盒 (kit)，所述試劑盒包括具有SEQ ID NO 1的檢測探針，具有SEQ ID N02和SEQ ID NO 3的 擴增引物對，以及包括SEQ ID NO 4的對照核酸。
[0016] 如本文中所描述的，使用包括SEQ ID NO 4的序列的對照核酸和通過具有SEQ ID NO 1的探針的改善檢測，有助于開發對多個參數和/或核酸類型進行，而對所述不同參數 和/或核酸類型使用相同內部對照核酸序列（internal control nucleic acid sequence) 的改善的同時測定法。因此，它有助于在各種水平上減少對應實驗的整體復雜度：例如，僅 必須設計一個內部對照核酸序列，并將其加入到相應的擴增混合物，從而節省用于設計和 合成或購買多個對照核酸序列的時間和成本。可以簡化（streamline) -個或多個測定法， 并且降低處理錯誤的風險。此外，可以在相同條件下同時進行的一個測定法或并行測定法 中采用的對照核酸序列越不同，作為結果而調整相應條件可能越復雜（the more complex it may result to adjust the respective conditions)。此外，使用適合于多個核酸的 單個對照，所述對照可以從單個來源分配到含有所述不同目標核酸的不同容器中。在一些 實施方案中，所述單個對照核酸序列也可以充當定性對照和充當定量對照。
[0017] 如本文中的實施例所示，通過使用具有SEQ ID NO 1序列的探針對包括SEQ ID NO 4的對照核酸的檢測改善，提高了根據EP 2759604中描述的方法實施測量的可靠性。具有 SEQ ID NO 1序列的探針不與EP 2759604中公開的任何寡核苷酸序列重疊，特別是不與具 有SEQ ID NO 5序列的探針（在EP2759604中公開為SEQ ID NO 52)重疊，在當前實施例 中，已針對所述具有SEQ ID NO 5序列的探針測試了 SEQ ID NO 1。
[0018] 使用包括SEQ ID NO 4的序列的對照核酸和通過具有SEQ ID NO 1的探針改善檢 測的方法可以如下有利地應用（A process in which the use of a control nucleic acid comprising the sequence of SEQ ID NO 4with the improved detection by a probe with SEQ ID NO lean be advantageously applied is the following)：
[0019] -種用于在有內部對照的情況下分離并同時擴增第一和第二目標核酸的方法， 所述第一和第二核酸可以存在于一個或多個流體樣品中（A process for internally controlled isolating and simultaneously amplifying a first and a second target nucleic acid that may be present in one or more fluid samples)，所述方法包括下 列自動化步驟：
[0020] a.將包括SEQ ID NO 4序列的內部對照核酸加入到每個所述流體樣品（each of said fluid samples)，
[0021] b.在一定的條件下在一個或多個容器中將固體支持材料和所述一個或多個流體 樣品組合在一起達一定的時間段，所述條件和時間段足以允許包括在存在于所述一個或 多個流體樣品上的情況下的所述目標核酸和所述內部對照核酸的核酸在所述固體支持材 料上固定化（combining together a solid support material and said one or more fluid samples in one or more vessels for a period of time and under conditions sufficient to permit nucleic acids comprising the target nucleic acids, if present on said one or more fluid samples, and the internal control nucleic acid to be immobilized on the solid support material)；
[0022] c.在分離站（separation station)中將固體支持材料與存在于流體樣品中的其 它材料分離，
[0023] d.在所述分離站中純化核酸，并且使用清洗緩沖劑清洗固體支持材料一次或多 次，
[0024] e.在至少兩個反應容器中使純化的目標核酸和純化的內部對照核酸接觸擴增試 劑，所述擴增試劑包括針對每個所述目標核酸的不同引物組和探針以及針對所述內部對照 核酸的包括具有SEQ ID NO 2的第一引物和具有SEQ ID NO 3的第二引物的引物組和具有 SEQ ID NO 1的探針，其中第一反應容器包括針對所述第一目標核酸的引物和探針，并且至 少第二反應容器包括針對所述第二目標核酸的引物和探針，并且其中所述針對第一目標核 酸的引物和探針不存在于（absent from)所述第二反應容器，并且所述針對第二目標核酸 的引物和探針不存在于所述第一反應容器，
[0025] f.在一定的條件下在所述反應容器中將所述純化的目標核酸和所述純化的內部 對照核酸與所述擴增試劑孵育一定的時間段，所述條件和時間段足以發生指示所述目標核 酸的存在或缺乏的擴增反應，
[0026] g.檢測并測量由所述目標核酸的擴增產物生成的并且與所述目標核酸的濃度成 比例的信號，并且檢測并測量由所述內部對照核酸生成的信號，
[0027] 其中對于所述第一和第二反應容器以及如此對于所述目標核酸和所述內部對照 核酸，在步驟d.到g.中用于擴增和檢測的條件是相同的。
[0028] 作為本文所描述的方法的優點之一，在可能的后續實驗中對具體的生物樣品檢 測其它核酸無需涉及另一個樣品制備規程及加入不同內部對照核酸（the testing of a particular biological sample for other nucleic acids in possible subsequent experiments need not involve another sample preparation procedure with the addition of a different internal control nucleic acid)，因為包括 SEQ ID NO 4 的 對照可以用于為不同核酸擴增作對照。因此，一旦已經加入內部對照核酸，就可以在相同條 件下在相同樣品中測試其他參數。
[0029] 上文描述的內部對照核酸是非競爭性的。
[0030] "非競爭性內部對照核"酸與目標具有不同的引物結合位點，從而結合不同引物。 這種設置的優點特別包括如下的實情：在反應混合物中的不同核酸的單個擴增事件可以彼 此獨立地發生而無任何競爭效果。因此，關于測定法的檢測限沒有發生不利效果，在競爭設 置中情況就可以如此。
[0031] 本文描述的方法涉及針對每個所述目標核酸和針對所述內部對照核酸的不同引 物組的事實使所述方法相當靈活。在該非競爭性設置中，不必要如在競爭性設置的情況下 一樣將目標特異性結合位點引入到對照核酸中，并且避免了競爭性設置的缺點，如對擴增 試劑的競爭。在非競爭性設置中，內部對照核酸與任何目標序列具有不同的序列，以便不競 爭它們的引物和/或探針。內部對照核酸的序列與流體樣品中的其他核酸序列不同。作為 示例，如果流體樣品衍生于人類，那么內部對照核酸沒有也在人類中內源性地發生的序列。 因此，序列中的差異至少足夠顯著，從而在嚴格條件下不允許引物和/或探針與相應的一 種或多種內源性核酸（respective endogenous nucleic acid or acids)結合，如此不使 設置成為競爭性的。SEQ ID NO 4是一種最初基于天然存在的基因組的雜混序列。如在本 領域中已知，"雜混"是指將一些堿基突變引入到序列中。在SEQ ID NO 4的情況下，在本發 明中使用的內部對照核酸的序列相對于衍生其的天然存在基因是實質性改變的。
[0032] 包括如本文描述的自動化步驟的方法還顯示各種另外的優點：
[0033] 在現有技術中已經作為一項挑戰的是，在單個反應容器中進行的多重測定法 (multiplex assay)中的不同目標核酸的數量限于適當標記物的數量。在實時PCR測定法 中，例如，熒光染料光譜的潛在重疊對測定法性能具有很大的影響（假陽性結果的風險，較 低精度等）。因此，為了保證診斷測試的期望性能，相應的熒光團必須經過仔細選擇并且是 光譜上完全分開的。通常，不同的可用熒光團的數量對應于PCR儀熒光