一株木質纖維素類物質高效降解菌m2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株木質纖維素類物質高效降解菌M2及其應用。
【背景技術】
[0002] 我國是一個農業大國，農業廢棄物產生量極其巨大，由于受經濟效益和技術普及 的限制，農業廢棄物大都粗放低效利用且閑置狀況嚴重，造成資源浪費和環境污染，廢棄物 已經成為中國最大的污染源。而在農業廢棄物存在著大量的木質纖維素，亟待人們去開發 利用。
[0003] 木質纖維素是自然界中僅次于纖維素的第二豐富的有機可再生資源，也是微生物 最難降解的成分之一。近年來，某些降解木質素的真菌已開始在實際中得以應用，但仍有待 進一步開發。木質素微生物降解的應用主要有：造紙工業；飼料工業；發酵與食品工業；生 物物肥料環境保護；木素酶的生物漂白技術，等等。
[0004] 目前農業有機固體廢棄通常通過能源化利用、有機肥料、禽畜飼料、可食用菌培養 基料和工業原料進行利用。在利用農業廢棄物的生產實踐中，物理、化學和生物處理方法 經常結合使用，而其中生物處理方法尤其是利用微生物處理代表了今后的發展趨勢。生物 方法就是指利用木質素降解酶去降解木質纖維材料中的木質素，從而使木質素-半纖維 素-纖維素結構解體，纖維素得以暴露出來供后續步驟處理與傳統的機械、物理化學類法 相比，生物處理法的優點是能耗低，所需環境條件溫和，避免了傳統化學處理、機械處理技 術等耗能較多、存在環境污染等缺點，從成本和設備角度考慮，生物脫木質素法占有獨特的 優勢。但是，目前的生物處理法有一個很大的弱點限制了它的應用，這就是生物處理法中的 關鍵角色-木質素降解酶的活性普遍不高，從而導致處理效率較低，如果能利用基因工程 和傳統的生物技術對菌種和酶進行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脫木質素法則有 望應用于大規模工業生產。
[0005] 而目前應用最廣泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作為一種新的農業技術措施，在 發展高產、優質、高效農業中的作用逐漸被人們所認識。傳統的微生物肥料己經在大面積推 廣應用中，新型的微生物菌肥品種不斷開發出來。微生物肥是由具有特殊效能的微生物經 過發酵而制成的、含有大量有益微生物、對作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活動，將作物不能吸收利用的物質轉化為可被作物吸收利用的營養物， 改善作物的營養條件，有些兼有刺激作物生長或增強抗病性的作用，以提高作物產量，改善 農產品品質。它既能增加農產品的出日創匯，又具有工農業有機廢物有效利用、防止環境污 染、改進土壤結構、提高土壤肥力和保護生態良性循環的巨大社會效益和生態效益。
[0006] 國內的研究大多數為真菌降解木質纖維素。但是，利用真菌降解木質纖維素普遍 存在酶活力較低的問題。由于芽孢桿菌繁殖較快，發酵周期短，可應用于工業生產，且芽孢 桿菌產生的纖維素酶一般作用條件為中性或偏堿性，這在制漿、造紙和洗滌劑工業等污染 行業的廢水治理上有著潛在的應用前景，因此從芽孢桿菌中篩選出有效菌株應用于木質纖 維素降解具有一定的實際意義及開發前景。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是為了提供一株木質素高效降解菌M2及其應用。
[0008] 本發明的一株木質素高效降解菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp. )M2,保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 保藏日期為2014年12月12日，保藏號CGMCC No. 10166。
[0009] 本發明的一株木質素高效降解菌M2用于降解木質素上。
[0010] 本發明的有益效果如下：
[0011] 本發明的芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2增值迅速，適應性強，應用廣泛耐鹽性為 NaCl濃度10%，耐熱性為70°C;連續傳代培養10次，菌株生長情況、產酶情況以及酶活力穩 定，無退化現象；對袋料木耳廢料和玉米秸桿具有明顯的降解效果，經芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2發酵處理后的袋料木耳廢料的失重率在35%以上，經芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2 發酵處理后的玉米秸桿的失重率在30%以上；具有木質素降解能力，可以高效降解木質 素，經復合微生物菌劑發酵處理的玉米秸桿中木質素含量是經芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2 發酵處理的玉米秸桿中木質素含量的2.8倍，作為單一菌株芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2對 木質素的降解能力強于復合微生物菌劑；在降解樣品時，不影響樣品中的主要元素含量，不 會導致試樣中的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量變化，保存樣品肥效。
[0012] 本發明從袋料木耳廢料、林間朽木和林間土壤中分離篩選出能夠以木質素為唯一 碳源生長的原始菌株，確定對木質素的降解能力以及種屬關系，為將來復合微生物菌劑構 建奠定基礎。將為我國農業資源的有效化利用提供有力幫助。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明芽孢桿菌屬（Bacillus sp. )M2培養12h后的掃描電子顯微鏡圖 (X20, 000)；
[0014] 圖2為16S rDNA序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為Maker DL2000,2泳道為菌株M2 ;
[0015] 圖3為回收后的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為Maker DL2000, 2 泳道為菌株M2 ;
[0016] 圖4為陽性克隆子篩選的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖其中，1泳道為Maker DL2000, 2 泳道為菌株M2 ;
[0017] 圖5為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2的系統進化樹；
[0018] 圖6為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2對袋料木耳廢料的失重率圖；
[0019] 圖7為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2對玉米秸桿的失重率圖；
[0020] 圖8為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2菌株降解后玉米秸桿中各組分含量柱 狀圖；其中，1為木質素含量柱狀圖；2為纖維素含量柱狀圖；3為半纖維素含量柱狀圖；
[0021] 圖9為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2菌株發酵處理后玉米秸桿中全氮全磷 和全鉀含量柱狀圖；其中，1為全氮含量柱狀圖；2為全磷含量柱狀圖；3為全鉀含量柱狀 圖；
[0022] 圖10為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2菌株發酵處理后玉米秸桿中速效磷含 量柱狀圖；
[0023] 圖11為本發明芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2菌株發酵處理后玉米秸桿中速效鉀含 量柱狀圖。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0024] 一：本實施方式的一株木質纖維素類物質高效降解菌M2,它為芽 孢桿菌（Bacillus sp.)M2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年12月12日，保藏號CGMCC NO. 10166。
[0025] 本實施方式的芽孢桿菌（Bacillus sp. )M2為革蘭氏陽性菌，該菌株菌體形態為桿 狀，菌體大小為0. 68~0. 76 X 1. 9~2. 4 μ m，形成芽孢，有鞭毛，無莢膜，；在LB培養基上 形成圓形、透明、白色、扁平、表面粗糙、邊緣鋸齒狀的菌落（如圖1所示）。
[0026] 該菌株的生理生化反應結果共20項、30個指標；結合形態與生理生化反應結果， 比對《伯杰氏芽孢桿菌鑒定手冊》確定該菌株的種屬，結果如表1所示。
[0027] 根據《常見芽孢桿菌系統鑒定手冊》和《伯杰芽孢桿菌手冊》對分離出的芽孢桿菌 (Bacillus sp. )M2進行進行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、熒光色素、甲基紅、七葉苷溶解、 明膠液化、石蕊牛乳胨化及產酸、脂酶、淀粉水解、V.P.測定、檸檬酸鹽利用、纖維素降解、 3-酮基乳糖利用、苯丙氨酸脫氨酶、色氨酸脫氨酶、耐熱熱性、耐鹽性生理生化實驗的檢測 和鑒定。結果表明芽孢桿菌（Bacillus sp.)M2為革蘭氏陽性菌，耐鹽性為NaCl濃度10%， 耐熱性為70°C，可產生接觸酶和脲酶，但不能產生氧化酶、脂酶、苯丙氨酸脫氨酶、色氨酸脫 氨酶和熒光色素，甲基紅、檸檬酸鹽利用、V.P.試驗、糖醇發酵（甘露糖）、石蕊牛乳胨化、七 葉苷溶解和石蕊牛乳產酸表現為陽性，淀粉水解、明膠液化、纖維素降解和3-酮基乳糖利 用表現為陰性。
[0028] 表1菌株M2的形態學特征與生理生化鑒定結果
[0029]
[0031] 本實施方式的木質素高效降解菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.)M2的篩選方法如 下：
[0032] 1、篩選方法
[0033] 取IOg樣品在無菌條件下充分研磨，加入裝有90mL無菌水（帶玻璃珠）的三角瓶 中，振蕩20min。取5mL樣品懸液接入裝有IOOmL液體LB培養基的三角瓶中，37°C，180r/ min振蕩培養8h ;將菌液分別制成稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的樣液，各取 200 μ L涂于木質素篩選培養基平板，37°C恒溫培養48h，根據菌落生長情況調整稀釋梯度。 保持培養條件不變，48h后挑取各平板上的單菌落在木質素篩選培養基平板上反復劃線純 化。挑取純化后的單菌落點接于木質素苯胺