瓊氏不動桿菌zjutfet-1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種（R)-氯丁酸的制備方法，特別涉及一株瓊氏不動桿菌 (Acinetobacter junii)及其在制備（R)-氯丁酸中的應用。 (二）
【背景技術】
[0002] 現有技術中制作2-氯丁酸傳統工藝比較多，通常用磷及磷的氯化物作為催化劑， 如以正丁酸為原料，五氯化磷為催化劑，通氯氣進行氯化反應。常壓，溫度控制150-200°C， 反應時間20-50h。反應完畢后，粗料精餾。該反應雖然轉化率較好（97%-99%)，但副產 物3-氯丁酸較多（5% -10% )，反應時間較長，溫度較高，且催化劑無法回收再利用，成固 廢。
[0003]目前為止，生物拆分獲得2-氯丁酸的方法還沒有被應用。 (三）
【發明內容】
[0004] 本發明目的是提供一種具有較好立體選擇性的菌株一瓊氏不動桿菌 (Acinetobacter junii) z jutfet-Ι及其在拆分2-氯丁酸甲酯中的應用。
[0005] 本發明采用的技術方案是：
[0006] 本發明提供一株新菌株一瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii) zjutfet-1， 保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2015年9月6日，保藏編號：CCTCC NO. M 2015511，保藏地址為中國武漢武漢大學，郵編430072。
[0007] 本發明還提供一種所述瓊氏不動桿菌z jutfet-Ι在拆分2-氯丁酸甲酯制備 (R)-2-氯丁酸中的應用，具體所述的應用是以瓊氏不動桿菌zjutfet-Ι經發酵培養獲得的 濕菌體為催化劑，以2-氯丁酸甲酯為底物，以pH = 7磷酸緩沖液為反應介質，在25-37Γ、 IOO-ISOrpm條件下進行催化反應，反應完全后，獲得含（S)-2-氯丁酸和（R)-2-氯丁酸的混 合液，將混合液分離純化，獲得（R)-2-氯丁酸。
[0008] 進一步，所述催化劑用量以濕菌體重量計為10~80g/L緩沖液（優選20~80g/ L，最優選20g/L)，所述底物體積終濃度占緩沖液體積的0. 1-4. 0% (優選1. 0% )。
[0009] 進一步，本發明所述濕菌體的制備方法為：
[0010] (1)將瓊氏不動桿菌zjutfet-Ι接種至斜面培養基，在30°C培養ld，獲得斜面菌 落；所用斜面培養基終濃度組成為：蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂17g/ L，溶劑為蒸餾水，pH值為7. 0 ;
[0011] (2)將斜面菌落接種于種子培養基，在30°C培養16h，獲得種子液；所述種子培 養基終濃度組成為：蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶劑為蒸餾水，pH值為 7. 0 ；
[0012] (3)將種子液以體積濃度0. 2%接種量接種于發酵培養基，在30°C、180rpm的條件 下培養48h，將發酵液離心，棄上清液，獲得濕菌體；發酵培養基終濃度組成：蛋白胨10g/L、 蔗糖 5g/L、K2HPO4 10g/L、MgSO4 0. 5g/L，溶劑為蒸餾水，pH 值為 7. 0。
[0013] 進一步，所述混合液分離純化的方法：反應結束后，用HCl調節混合液pH值至 1-2,加入等體積的乙酸乙酯進行萃取，SOOOrpm離心3min，分層，得到有機相，取上層即獲 得（R)-氯丁酸。
[0014] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：
[0015] 本發明提供一株新菌株一瓊氏不動桿菌z jutf et-Ι，該菌株對2-氯丁酸甲酯催化 2h，eep達到了 95%，底物轉化率達到了 21. 5%。 (四）
【附圖說明】
[0016] 圖1為橄欖油作為唯一碳源菌株篩選，羅丹明B作為顯色劑的熒光照片。
[0017] 圖2為橄欖油作為唯一碳源菌株篩選，溴甲酚紫作為顯色劑的熒光照片。
[0018] 圖3為瓊式不動桿菌zjutfet-Ι經過革蘭氏染色后的菌落形態。
[0019] 圖4為瓊式不動桿菌zjutfet-Ι系統發育樹。 (五）
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0021] 下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0022] 實施例1 :菌株篩選
[0023] 1、瓊氏不動桿菌(Acinetobacter iunii) z iutfet~l 的初篩和復篩
[0024] (1)初篩：
[0025] a)、橄欖油作為誘導劑，羅丹明B作為顯色劑。取Ig 土樣（采集于浙江省某高校 下水道）加入到9mL生理鹽水中，充分搖勾，進行倍比稀釋，梯度為10 9、10 n、10 13涂布于含 終濃度為l〇g/L羅丹明B和終濃度120mL/L橄欖油乳化液（3%的聚乙烯醇與橄欖油按3:1 混合，勻漿機攪拌）的初篩培養基平板中進行篩選，30°C培養至有菌落生長后，將平板置于 365nm紫外線下觀察菌落周圍熒光圈有無情況，結果見圖1所示。
[0026] 初篩培養基終濃度組成（g/L):蛋白胨10,酵母提取物5，NaCl 10,瓊脂17,溶劑為 蒸餾水，pH值為7.0。
[0027] b)、農藥中間體作為唯一碳源，溴甲酚紫作為顯色劑
[0028] 取Ig 土樣（采集于浙江省某高校下水道）加入到9mL生理鹽水中，充分搖勻， 進行倍比稀釋，梯度為10 9、10 11UO 13涂布于含終濃度為20g/L2-氯丁酸甲酯和溴甲酚紫 (10mg/ml)50ml/L的菌種初篩固體培養基，30°C培養2天后，將培養基置于365nm紫外線下 觀察菌落周圍熒光變色圈及大小情況，結果見圖2。
[0029] (2)復篩：挑取在365nm紫外下具有熒光圈的菌落接種于LB固體培養基上，30°C 培養l-2d，分離純化至平板上有單菌落產生，挑取單菌落至種子培養基中，30°C培養16h 后，取ImL菌液進行稀釋，稀釋至10 7、10 8、10 9后，涂布于復篩培養基中，于30°C進行培養 2d，獲得菌株 z jutfet-1。
[0030] LB固體培養基終濃度組成（g/L):蛋白胨10,酵母提取物5, NaCl 10,瓊脂17,溶 劑為蒸餾水，pH值為7.0。
[0031] 種子培養基終濃度組成（g/L):蛋白胨10,酵母提取物5，NaCl 10,溶劑為蒸餾水， pH值為7.0。
[0032] 復篩培養基終濃度（g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,蔗糖10, K2HPO4 LMgSO4 ·7Η20 〇. 5,溶劑為蒸餾水，pH值為7. 0。
[0033] 2、菌株 z jutfet-Ι 的鑒定
[0034] 菌株zjutfet-Ι形態觀察：將篩選到的菌株zjutfet-Ι劃線于LB固體培養基中， 30°C倒置培養2d，觀察單菌落形狀、大小、顏色和突起等特征，并且對其進行革蘭氏染色 (圖3)，革蘭氏陰性菌，桿狀，無芽孢；菌落