表達嵌合抗原受體的臍血有核細胞及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤細胞治療領域，更具體地，涉及對表達EGFRvin陽性腫瘤的轉基 因細胞治療領域。
【背景技術】
[0002] 過繼免疫治療是將自體或異體抗腫瘤效應細胞的前體細胞，在體外用IL-2、抗 CD3單抗等誘導、激活和擴增，然后轉輸給患者，以達到治療和預防復發的目的。目前已經開 發出CTL、ΝΚΤ、γ δ T、TIL、CIK、DC-CIK、CAR-T等多種過繼免疫療法，然而這些過繼免疫療 法在療效及副作用上仍具有較大的挑戰。CAR-T免疫療法為最新技術，移植細胞可在體內擴 增近千倍且存活長達6個月并持續表達抗原受體。在臨床上顯示出很好的療效，在血系腫 瘤，有47項相關報道，均取得了顯著的治療效果。然而，CAR-T在治療實體瘤上并未取得理 想的臨床療效。另外，目前發現的腫瘤特異性抗原（TSA)較少，CAR-T細胞治療大多數靶向 腫瘤相關抗原（TAA)，腫瘤相關抗原在其它正常組織中也表達，因此，CAR-T治療常常伴隨 著嚴重的脫靶細胞會攻擊正常細胞而給患者帶來新的損傷。此治療常常伴隨著嚴重的脫靶 效應，CAR-T細胞攻擊正常細胞而給患者帶來新的損傷。
[0003] EGFRvIII是一種表皮生長因子受體的突變型，該突變體在細胞表面表達，是腫瘤 特異性抗原（TSA)，其可在50% -60%的膠質母細胞瘤，70% -80%的乳腺及卵巢癌及大約 16%肺癌中表達（Wikstrand等，Cancer Res. 55:3140-3148(1995))，是腫瘤治療中極富吸 引力的靶部位。
[0004] 目前，諸多學者已經制備出針對EGFRvIII的CAR-T細胞，在體外殺傷試驗及動物 試驗中取得了一定的療效，然而，其在臨床試驗中并未取得理想的療效。原因可能有以下幾 點，首先，惡性腫瘤細胞存在高度的異質性，同一患者中的腫瘤細胞并非都表達此抗原，滅 殺單一類型的細胞并不能夠根治腫瘤；其次，腫瘤患者體內T細胞長期受腫瘤細胞逃避機 制的影響，其在遺傳學上可能存在一定的缺陷，其殺傷作用可能降低；再次，腫瘤患者免疫 功能低下，單一的CAR-T細胞移植雖然能夠殺傷特異性腫瘤細胞，然而其未必能夠重建患 者免疫功能，提高患者對腫瘤的免疫功能。
[0005] CAR-T細胞治療在血系腫瘤良好的治療效果也預示著其治療實體瘤的潛能，諸多 學者不斷地對CAR-T細胞進行改進以期在實體瘤治療中取得突破。本發明使用臍血有核細 胞作為宿主細胞，通過慢病毒轉染使其表達CAR，在對野生型EGFRvIII陽性細胞的體外殺 傷及EGFRvIII陽性膠質瘤動物腫瘤治療中取得了良好的效果。臍帶血中淋巴細胞相對不 成熟，抗原性較弱，而且臍血中還富含造血干細胞、間質干細胞、間質前體細胞和上皮樣前 體細胞等多種原始細胞，在腫瘤治療中可能具有更長期持久的療效。另外臍帶血是廢棄的 血源，對供體沒有負擔，來源廣泛，易于收集和保存；將有望成為通用型腫瘤治療產品。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的首先是構建一種嵌合抗原受體（CAR)。
[0007] 本發明所述的嵌合抗原受體（CAR)為一段融合多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 ;所述CAR包含抗原識別結構域、跨膜結構域和細胞內T細胞信號傳導結構域；所述抗 原識別結構域包括針對表皮生長因子受體3號突變體（EGFRvIII)的單克隆抗體或其可變 區或其抗原的結合區域。
[0008] 根據本發明所述的嵌合抗原受體（CAR)的進一步特征，所述抗原識別結構域包 括：IgG κ信號肽、以連接肽連接重、輕鏈形成的單鏈抗體片段（scFv);所述抗原識別結構 域的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2;所述IgG κ信號肽的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3;所述單 鏈抗體片段（scFv)的氨基酸序列為SEQ ID N0:4。
[0009] 根據本發明所述的嵌合抗原受體（CAR)的進一步特征，所述跨膜結構域包括：鉸 鏈結構以及跨膜區；所述跨膜結構域的氨基酸序列為SEQ ID N0:5 ;所述鉸鏈結構的氨基酸 序列為SEQ ID N0:6;所述跨膜區的氨基酸序列為SEQ ID N0:7。
[0010] 根據本發明所述的嵌合抗原受體（CAR)的進一步特征，所述細胞內T細胞信號傳 導結構域包含CD137和CD247 ;所述細胞內T細胞信號傳導結構域的氨基酸序列為SEQ ID N0:8;所述CD137的氨基酸序列為SEQ ID N0:9;所述CD247的氨基酸序列為SEQ ID N0:10。
[0011] 本發明還提供了一種核酸分子。所述核酸分子編碼本發明所述的嵌合抗原受體 (CAR) 〇
[0012] 本發明還提供了一種表達載體。所述表達載體含有本發明所述的核酸分子。此載 體能夠高效轉導臍血有核細胞并在其中穩定表達。
[0013] 本發明設計了編碼靶向EGFRvIII抗原的嵌合抗原受體（CAR)的核酸 MD 1 -1 -⑶8 α -⑶137-⑶247 (由上海捷瑞生物科技有限公司合成），其中MD 1 -1編碼高 親和結合EGFRvIII的單鏈抗體（scFv)，其由MDl突變形成。CD8a編碼鉸鏈及跨膜 結構，⑶137、⑶247編碼T細胞激活及信號傳導結構。然后，將此核酸連接到Fuw載 體（Fuw空載體由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院惠贈）構建了慢病毒表達載體 Fuw-IgGk-MDl-1-CD8 a -CD137-CD247 及其同型對照載體 Fuw-EGFP，將該載體轉染 293T 細胞包裝病毒，在本發明的一個實施方案中，每一個IOcm皿的293T細胞可包裝滴度為 2X10STU的病毒，病毒可進行凍存，復蘇后細胞滴度將下降為原來的50%左右。
[0014] 本發明還提供了一種表達嵌合抗原受體（CAR)的臍血有核細胞。
[0015] 本發明所述的表達嵌合抗原受體（CAR)的臍血有核細胞含有本發明所述的核酸 分子，或者含有本發明所述的載體，所述核酸分子通過病毒、脂質體、電轉染或轉座子系統 轉染至臍血有核細胞，在靶細胞表達為嵌合抗原受體（CAR)。
[0016] 優選地，所述臍血有核細胞來源于人或動物臍血，是通過梯度密度離心、流式分 選、免疫磁珠分選方法分離獲得的有核細胞群，包括：T細胞、殺傷細胞、造血干細胞、間質 干細胞、間質前體細胞和上皮樣前體細胞。
[0017] 本發明還提供了所述的表達嵌合抗原受體（CAR)的臍血有核細胞的用途。
[0018] 本發明所述的表達嵌合抗原受體（CAR)的臍血有核細胞可用于制備治療或預防 神經膠質瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌的藥物，該藥物能通過CAR靶向EGFRvIII抗原，高效殺 傷腫瘤細胞的細胞群，例如靶向殺傷EGFRvIII陽性腫瘤細胞，并以其為主要成份制備一種 可預防和治療多種EGFRvIII陽性腫瘤如神經膠質瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤的藥品。
[0019] 本發明還提供了一種細胞注射液。
[0020] 本發明所述的細胞注射液包括本發明所述的表達嵌合抗原受體（CAR)的臍血有 核細胞。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示的是針對EGFRvIII抗原的嵌合抗原受體（CAR)的慢病毒表達載體 Fuw-CAR(A)及其同型對照載體Fuw-EGFP (B)結構圖。其中Fuw-EGFP由中國科學院廣州生 物醫院與健康研究院惠贈，Fuw-CAR為將核酸MDl-I-⑶8 α -⑶137-⑶247 (由上海捷瑞生物 科技有限公司合成）連接至Fuw空表達載體上形成。
[0022] 圖2顯示的是EcoRl和BamHl雙酶切鑒定慢病毒質粒的核酸電泳圖，其中1-6泳 道分別為六個Fuw-CAR質粒樣品酶切后及原質粒電泳圖，7-8為Fuw-EGFP酶切后及其原質 粒電泳圖。表明本實施方案構建的載體大小與設計相符。
[0023] 圖3顯示的是使用PEI轉染293Τ細胞包裝慢病毒的轉染效率，轉染效率在90%以 上。
[0024] 圖4顯示的是單獨使用T細胞激活因子⑶3的使用方法及濃度與T細胞增殖效果 關