一種結核病檢測多肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及結核病檢測領域，尤其涉及一種結核檢測多肽及其應用。
【背景技術】
[0002]由人結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)所引起的結核病是嚴重危害人類健康的傳染病。結核病是WHO重點控制的傳染性疾病，目前仍是嚴重危害人民健康的公共衛生問題。據有關資料統計，全球約有1/3的人口感染結核菌，現有結核病人約2000萬，每年新發病800萬?1000萬人，每年約有200萬人死于結核病，是其它所有傳染病死亡人數的總和。我國的結核病疫情極其嚴峻，現有結核感染者5億，占全球的1/4，每年有13萬人死于結核病，為其它各類傳染病和寄生蟲病死亡人數總和的2倍。近二、三十年來由于人口流動，耐藥結核菌傳播，艾滋病等因素影響，結核病疫情在全球范圍內回升。如今已成為所有傳染病中的最大死亡原因(已經超過了狂犬病)，成為青年人的第一殺手。
[0003]目前結核病控制存在的最主要問題是病人發現率低，治愈率低。在診斷方面，現有的檢查方法均存在著一定的局限性，難以達到快速、準確的結核病診斷。因此，加大結核分枝桿菌的基礎研究，尋找快速、靈敏、簡便、實用的結核病診斷新方法，提高結核病人的檢出率，是目前結核病研究需要迫切解決的問題。
[0004]血清學檢查是目前結核病實驗室三大診斷方法之一，相對細菌學和分子生物學檢查具有多種優點，其方法簡單、快速，價格便宜，不需要特殊的大型檢測設備，即使基層醫院也能夠廣泛開展，對痰涂片陰性的肺結核，肺外結核和不易獲得痰標本的兒童結核的診斷均具有重要價值，成為了早期發現與診斷結核病的理想選擇。結核病的常規血清學檢查存在著敏感性、特異性較低的缺點，限制了臨床應用，主要原因是難以得到高敏感性、高特異性的檢測標識物。
【發明內容】
[0005]本發明為解決現有技術中的上述問題提出的一種高特異性、高敏感性結核病檢測多肽，以及相關的應用。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種結核特異性檢測多肽，其多肽序列為SEQ ID N0.1 所示。
[0007]通過對病人和健康人血清或血漿樣本中的小分子多肽進行分離富集，采用4800Plus MALDI T0F/T0F?質譜儀對不同樣本中的多肽分子進行鑒定，獲得在不同樣本的分布具有顯著性差異的多肽分子，通過數據分析比較，我們發現如SEQ ID N0.1所示多肽分子P1可以有效區分結核病人和健康人的血清或者血漿樣本，在結核病人血清或者血漿中的含量顯著低于健康人，進一步利用數據庫對該多肽來源的蛋白一一凝集素進行血清標本的檢測發現，結核病人血清中凝集素的含量顯著高于健康人，利用該蛋白可以有效區分結核病人和健康對照，可用于結核病的血清學檢測。
[0008]另一方面，本發明還提供一種檢測結核病的試劑盒，將上述的結核特異性檢測多肽作為檢測標識物。
[0009]同時，本發明還提供一種上述的結核特異性檢測多肽的特異性抗體。
[0010]另一方面，本發明還包括上述特異性抗體在制備結核檢測試劑盒中的應用。
[0011]本發明的結核特異性檢測多肽，應用于結核病的血清學檢測，敏感性高、特異性強；同時兼顧了血清學檢測方法簡單、快速，價格便宜的特點，不需要特殊的大型檢測設備，使得基層醫院也能夠廣泛開展高敏感性的結核病檢測；同時，本發明的結核特異性檢測多肽對痰涂片陰性的肺結核，肺外結核和不易獲得痰標本的兒童結核的診斷均具有重要價值。
【附圖說明】
[0012]圖1為結核特異性檢測多肽P1在不同標本中質譜檢測的響應值(A為血清標本；B為血漿標本)；
[0013]圖2為凝集素在不同血清標本中的ELISA檢測結果。
【具體實施方式】
[0014]本發明提供了一種結核特異性檢測多肽，其多肽序列為SEQ ID N0.1所示。
[0015]下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發明，但是下述實施例并不限制本發明范圍。
[0016]實施例1:結核病人血清血漿特異性多肽的鑒定
[0017]1實驗材料
[0018]1.1納米孔芯片
[0019]納米孔(Nanoporous，NPS)娃薄膜芯片由美國衛理公會醫院研究所的胡曄教授饋贈，是一種孔徑在1?lOOnm且具有顯著表面效應的多孔材料，不同孔徑的納米孔可以特異性吸附、分離小分子蛋白或多肽。
[0020]1.2結核病人，疾病對照及健康人血清
[0021]20例結核病人血清、血漿標本采集自上海市肺科醫院結核科門診或住院的結核病人，均為結核分枝桿菌培養陽性；20例非結核性疾病對照血清采集自上海市肺科醫院呼吸科門診確診的非結核病性呼吸系統疾病病人；23例健康人血清、血漿采集自上海市肺科醫院門診體檢的健康華東漢族人，均有卡介苗接種史。所有人選均排除了合并糖尿病、自身免疫性疾病及HIV感染。血清、血漿標本采集后分裝，-80°C凍存。
[0022]1.3主要化學試劑
[0023]乙臆(Acetonitrile，ACN)，三氣乙酸(Trifluoroaceticacid，TFA)，基質 α —氛基一 4 一輕基肉桂酸(α -cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)購自美國 Sigma 公司；CultureWell?分隔蓋玻片購自美國life technologies公司；標準多肽購自德國BrukerDaltonics 公司。
[0024]1.4主要儀器
[0025]AB4800MALD1-T0F系統(美國ABI公司);全自動高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；超純水分離系統(英國USF Elga公司)；普通離心機(德國eppendorf公司)；深低溫冰箱(美國Thermo Scientific公司)。
[0026]2方法及結果
[0027]2.1血清、血漿標本的預處理
[0028]用去離子配制含50% ACN和0.1 % TFA的樣本稀釋液，取2.8 μ 1加入到分裝離心后的25 μ 1血清、血漿標本中，使ACN的終濃度為5%，TFA為0.01 %，混勻后，置于桌面式漩渦振蕩儀室溫混合30分鐘。
[0029]2.2血清、血漿標本中多肽的分離提純
[0030]2.2.1在160°C烤箱中預先過夜烘烤納米孔芯片，或者將芯片貯存在干燥器中直到使用，以避免空氣中水分子對芯片表面的水合作用。
[0031]2.2.2使用壓縮空氣抹掉可能附著在芯片表面的任何微粒。
[0032]2.2.3按照檢測樣本數量，裁剪包含相同數量檢測孔的CultureWell分隔蓋玻片100%乙醇清潔后，用鑷子將蓋玻片放置于芯片表面，并保證蓋玻片與芯片的緊密貼合。
[0033]2.2.4用移液器吸取預處理的血清或血漿樣本5 μ L分別加入到蓋玻片3mm孔中，每個樣品制備2復孔，室溫濕盒中孵育30分鐘。
[0034]2.2.5用移液器吸取孔中殘留的樣本，加入10 μ L去離子水至各孔中進行沖洗，重復4次。
[0035]2.2.6為了模仿生物樣品的復雜度及評估小分子量多肽的富集效率，我們選取了一些已知分子量和濃度的標準多肽作為標準品，同時校正質譜分子量。包括標準多肽1045.5 (Sigma公司，分子量為1045.5Da)，2465 (Sigma公司，分子量為246f5Da)，原始濃度為1 ymol/L，用洗脫緩沖液(50% ACN+0.1% TFA) 1:50稀釋至使用濃度。
[0036]2.2.7用含有標準多肽的洗脫緩沖液6 μ L