用于使用乳酸脫氫酶轉化體從c1化合物以生物方式產生乳酸的組合物和方法
【專利說明】用于使用乳酸脫氫酶轉化體從C1化合物以生物方式產生 乳酸的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請依據35 U.S.C. § 119(e)要求臨時申請：2013年6月18日提交的美國申 請號61/836,609和2014年1月16日提交的美國申請號61/928, 390的權益，所述申請兩 者均以引用的方式整體并入本文。
[0003] 對序列表的引用
[0004] 依據37 C. F. R. § 1. 821與此同時通過EFS網以計算機可讀形式（CRF)以文件名 200206_414W0_SEQUENCE_LISTING. txt電子提交的"序列表"以引用的方式并入本文。序列 表的電子拷貝于2014年6月17日創建，并且在磁盤上的大小是222千字節。
[0005] 背景
[0006] 可以化學或生物方式產生的乳酸是一種廣泛使用的化合物，其使用范圍從化妝 品行業到食品行業到藥物和化學行業。因為乳酸含有兩個反應性官能團，即羧基和羥基， 所以它可經受向潛在適用化學品的多種化學轉化，所述化學品如氧化丙烯、乙醛、丙烯酸、 丙酸、2, 3-戊二酮和丙交酯（Varadarajan 和 Miller, Biotechnol. Progr. 15:845, 1999) 〇 近來，增加的注意力已指向使用乳酸產生聚乳酸（PLA)，其是一種用于制造生物塑料， 提供石油化學資源的更可持續替代物的可再生原材料。光學純乳酸可通過縮聚、解聚 和開環聚合的連續反應來聚合成高分子質量的PLAC SSdergird和stolt, Prog. Polym. Sci. 27:1123, 2002)。所得PLA聚合物在廣泛范圍應用中具有各種用途，所述應用包括防護 月艮、食品包裝、地膜、垃圾袋、剛性容器、收縮包裝和短暫保存期限托盤（Drumright等，Adv. Mater. 12:1841，2000 ;Vink 等，Polym. Degrad. Stabil. 80:403, 2003)。
[0007] 當前用于生物乳酸生產的碳水化合物原料是相對昂貴的。其它原料，如甲烷，可大 量廉價獲得。甲烷的轉化潛在代表一種用以達成顯著較低成本乳酸產生的途徑。然而，尚 未開發實現這個的實際方式。
[0008] 簡要概述
[0009] 在一個實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶（LDH)的外源性核酸的 非天然存在的C 1代謝細菌。
[0010] 在另一實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然 存在的C 1代謝微生物，其中所述C i代謝微生物是甲烷氧化菌。
[0011] 在另一實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然 存在的C1代謝微生物，其中所述C 謝微生物能夠使碳原料轉化成乳酸，并且其中所述碳 原料選自由甲烷、二氧化碳、一氧化碳、天然氣和合成氣組成的組。
[0012] 在某些實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然 存在的C1代謝微生物，其中所述c 謝微生物不是酵母。
[0013] 在其它實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然 存在的C 1代謝微生物，其中當在C i底物存在下在至少一組培養條件下培養時，所述非天然 存在的C1代謝微生物能夠產生相較于相應參照C i代謝微生物的乳酸更多的乳酸。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1描繪相較于在生長72小時之后的0D_，表達異源性乳酸脫氫酶（Idh)核酸的 某些重組莢膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus) Bath的乳酸產生水平。
[0016] 圖2描繪各種碳源的δ 13C分布。
[0017] 圖3描繪本發明的載體pMS3,其包含編碼復制起始蛋白（trfA)以及啟動子 (Pbla)、復制起點（oriV)、轉移起點（oriT)、多克隆位點（MCS)、卡那霉素抗性基因（KanR) 和啟動子（KanR_啟動子）和用于大腸桿菌（E. coli)的復制起點（pUC_0ri_rc)的序列。
[0018] 詳細描述
[0019] 本公開提供用于從碳原料生物合成乳酸的非天然存在的C1代謝微生物以及相關 組合物和方法。通常，碳原料包括C1底物。在一特定實施方案中，本發明提供一種包含編碼 乳酸脫氫酶（LDH)的外源性核酸的非天然存在的C1R謝細菌。本發明也提供一種包含編 碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然存在的(；代謝微生物，其中所述C 1代謝微生物是甲烷 氧化菌。在一特定實施方案中，本公開提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天 然存在的C 1代謝微生物，其中所述C 謝微生物能夠使碳原料轉化成乳酸。通常，碳原料 選自由甲烷、二氧化碳、一氧化碳、合成氣和天然氣組成的組。本發明進一步提供一種包含 編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然存在的C1代謝微生物，其中所述c 謝微生物不是 酵母。在另一實施方案中，本發明提供一種包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然存 在的C1代謝微生物，其中當在C i底物存在下在至少一組培養條件下培養時，所述非天然存 在的C1R謝微生物能夠產生相較于相應參照c 謝微生物的乳酸更多的乳酸。在另一實 施方案中，本發明提供包含編碼乳酸脫氫酶的外源性核酸的非天然存在的C1代謝微生物， 其中當在C 1底物存在下在至少一組培養條件下培養時，所述非天然存在的C i代謝微生物能 夠產生相較于相應參照C1代謝微生物的乳酸更多的乳酸。
[0020] 在更詳細闡述本公開之前，可有助于理解本公開的是提供待用于本文中的某些術 語的定義。其它定義在整篇本公開中闡述。
[0021 ] 在本描述中，對本文任何范圍的公開都意圖是對所述范圍內的任何數值的公開以 及對由所述范圍內的任何數值形成的任何范圍的公開，包括端點。如本文所用，除非另外指 示，否則術語"約"意指所指示范圍、值或結構的±20%。術語"基本上由…組成"使權利 要求的范圍限于指定材料或步驟，或不實質上影響要求保護的發明的基本和新型特征的那 些。應了解如本文所用的術語"一（a/an)"是指"一個或多個"列舉的組分。替代物"或" 的使用應被理解為意指替代物中的一個、兩個或其任何組合。如本文所用，術語"包括"、"具 有"和"包含"不排除存在未另外明確排除的其它要素。
[0022] 當與多肽結合使用時，術語"乳酸脫氫酶"和"LDH"在本文中可互換用于指具有乳 酸脫氫酶活性，即能夠催化丙酮酸還原成乳酸的多肽。在一些實施方案中，乳酸脫氫酶是催 化丙酮酸還原成L-乳酸的L-乳酸脫氫酶（EC I. 1. 1.27)。在其它實施方案中，乳酸脫氫酶 是催化丙酮酸還原成D-乳酸的D-乳酸脫氫酶（EC I. I. 1. 28)。
[0023] 術語"碳原料"在本文中是指能夠由本發明的非天然存在的C1代謝微生物代謝的 任何碳化合物，例如像C1底物。
[0024] 如本文所用，術語底物"是指缺乏碳-碳鍵的任何含碳分子。C i底物可見于天 然氣、非常規天然氣、合成氣中，并且包括例如像甲烷、甲醇、甲醛、甲酸（甲酸鹽）、一氧化 碳、二氧化碳、甲基化胺（例如甲胺、二甲胺、三甲胺等）、甲基化硫醇、甲基鹵素（例如溴甲 烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷等）、氰化物等的分子。
[0025] 如本文所用，術語"甲烷"是指具有化學式014的最簡單（C1)烷烴化合物，其是一 種在室溫和壓力下無色和無味的氣體。
[0026] 如本文所用，術語"天然氣"是指含有甲烷的天然存在的地下氣體混合物。天然氣 可通過常規方法（例如鉆探、注水）從多孔儲集層獲取。盡管主要由甲烷組成，但天然氣也 可包含其它輕質烷烴氣體（例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷）、二氧化碳、氮氣、硫化氫等或其任 何組合。
[0027] 術語"非常規天然氣"在本文中是指于具有低可滲透性，必須通過非常規方法（如 水力壓裂、水平鉆探或定向鉆探）達到的地層中產生的天然存在的氣體混合物。示例性非 常規天然氣沉積物包括在砂巖或碳酸鹽巖中形成的致密砂巖氣、在煤沉積物中形成并吸附 于煤粒子中的煤床甲烷、在細粒化頁巖石中形成并吸附于粘土粒子中或保持在小孔或微小 斷層內的頁巖氣、在低溫和高壓下在如海洋下和永凍層的地點中形成的是天然氣和水的結 晶組合的甲烷水合物。非常規天然氣相較于常規天然氣傾向于具有更可變組成，包括具有 潛在較高水平的乙烷、丙烷、丁烷、〇) 2或其任何組合。
[0028] 如本文所用，術語"合成氣體"或"合成氣"是指主要含有一氧化碳（CO)和氫氣 (H 2)的以合成方式產生的氣體混合物。合成氣可通過例如天然氣或液體烴的蒸汽重整或通 過煤、生物質或廢物的氣化來產生。合成氣也可包括甲烷、C0 2、H2S和相對于CO和H2呈較 小量的其它氣體。
[0029] 如本文所用，"(^代謝微生物"是指能夠使用（即代謝）C i底物作為能量、生物質來 源的任何微生物，并且可或可不使用其它碳底物（如糖和復合碳水化合物）來獲得能量和 生物質。C 1代謝微生物包括細菌（如甲烷氧化菌和甲基營養菌）和酵母。在某些實施方案 中，C1R謝微生物不包括光合微生物，如藻類。在某些實施方案中，C 1代謝微生物將為"專 性C1代謝微生物"，這意味著它需要C i底物作為它的能源。在其它實施方案中，將在C 1底 物存在下（即使用C1底物作為能源）培養C i代謝微生物（例如甲烷氧化菌）。
[0030] 如本文所用，術語"甲燒氧化菌"、"甲燒氧化細菌（methanotrophic bacterium) " 或"甲燒氧化細菌（methanotrophic bacteria) "在本文中可互換指代能夠利用甲燒的甲 基營養型細菌。舉例來說，來自天然氣的甲烷可用作生長的碳源和能源。如本文所用，術語 "甲烷氧化細菌"包括僅可利用甲烷（例如來自天然氣）來獲得碳源和能源的"專性甲烷氧 化細菌"和除甲烷之外，也天然地能夠使用如乙酸、丙酮酸、、蘋果酸或乙醇的多碳底物作為 它們的碳源和能源的"兼性甲烷氧化細菌"。
[0031] 如本文所用，術語"甲基營養菌"或"甲基營養型細菌"是指能夠使用一碳化合 物（即不含有碳-碳鍵的化合物）的任何細菌。在某些實施方案中，甲基營養型細菌可 為甲烷氧化菌。舉例來說，"甲烷氧化細菌"是指能夠利用甲烷作為它的主要碳源和能源 的任何甲基營養型細菌。示例性甲烷氧化細菌包括甲基單胞菌屬（Methylomonas)、甲基 桿菌屬（Methylobacter)、甲基球菌屬（Methylococcus)、甲基彎曲菌屬（Methylosinus)、 甲基孢囊菌屬（Methylocystis)、甲基微菌屬（Methylomicrobium)或甲燒單胞菌屬 (Methanomonas)。在某些其它實施方案中，甲基營養型細菌是"專性甲基營養型細菌"，其是 指局限于使用C 1底物來產生能量的細菌。
[0032] 如本文所用，術語"宿主"是指可用外源性核酸進行遺傳修飾以產生目標多肽（例 如乳酸脫氫酶）的細胞或微生物（例如甲烷氧化菌）。在某些實施方案中，宿主細胞可任選 已具有或被修飾以包括賦予與由外源性核酸編碼的外源性LDH相關或無關的所需性質的 其它遺傳修飾（例如丙酮酸脫羧酶缺失）。舉例來說，宿主細胞可具有以下遺傳修飾：使對 所產生的乳酸產物的利用最小或降低，使宿主細胞生長抑制劑的產生最小或降低，提供高 生長，提供對污染物或特定培養條件的耐受性（例如酸耐受性、殺生物劑抗性），賦予代謝 其它碳底物的能力，或賦予合成其它合乎需要的產物或中間體的能力。
[0033] 如本文所用，術語"核酸分子"和"核酸"可互換用于指代由共價連接的核苷酸亞單 位組成的聚合化合物。合成產生核酸包括使核酸復制的化學和生物方法。核酸包括多核糖 核酸（RNA)、多脫氧核糖核酸（DNA)，其兩者均可為單鏈或雙鏈。DNA包括cDNA、基因組DNA、 合成DNA、半合成DNA等。術語"LDH核酸"和"LDH編碼核酸"在本文中可互換用于指編碼 具有LDH活性的多肽的核酸。
[0034] 術語"多肽"和"蛋白質"在本文中可互換用于指代氨基酸的聚合物。
[0035] 如本文所用，術語"重組"或"非天然"（或"非天然存在"）可互換指代生物體、微 生物、細胞、核酸或載體包括至少一個遺傳改變或已通過引入外源性核酸而被修飾，或是指 細胞已被改變以使內源性核酸或基因的表達可被控制，其中所述改變或修飾通過遺傳工程 改造引入或誘導。遺傳改變包括例如引入編碼蛋白質或酶的可表達核酸的修飾，或其它核 酸添加、缺失、取代或對細胞的遺傳物質的其它功能性破壞，或通過本領域中已知的經典菌 株進化或定向分子進化方法實現的修飾。所述修飾包括例如在編碼區（及其功能性片段） 和非編碼調控區中的修飾，其中修飾改變基因或操縱子的表達。
[0036] 如本文所用，術語"轉化"和"轉化"是指將核酸（例如外源性或異源性核酸）引入 宿主細胞中。轉化的宿主細胞可攜帶染色體外或整合在染色體中的外源性或異源性核酸。 整合至宿主細胞基因組和自我復制性載體中通常導致轉化的核酸分子遺傳穩定遺傳。含有 轉化的核酸的宿主細胞可互換稱為"重組"或"非天然存在的"或"遺傳工程改造的"或"轉 化的"或"轉基因"細胞（例如細菌）。
[0037] 如本文所用，術語"相應參照C1代謝微生物"是指無 LDH編碼外源性核酸的相應C i 代謝微生物。
[0038] 當與核酸、多肽、化合物或活性結合使用時，術語"內源性"或"天然"可互換用于指 存在于野生型宿主細胞中的核酸、多肽、化合物或活性。當與細胞結合使用時，術語"天然" 是指野生型細胞。
[0039] 如本文所用，"異源性"或"外源性"核酸、構建體或序列在本文中可互換用于指不 是宿主細胞天然的核酸分子或核酸分子的部分，或已被改變或突變的宿主細胞天然的核酸 分子或核酸分子的部分，或在類似條件下相較于天然表達水平，表達改變的核酸分子。此 外，術語"異源性"和"外源性"可指生物活性與宿主細胞內源性生物活性不同或從其改變， 或不是宿主細胞天然的，而是代之以由引入宿主細胞中的核酸分子編碼。
[0040] 兩個或更多個核酸序列或兩個或更多個氨基酸序列之間的"同一性百分比"是由 序列共有的相同位置的數目的函數（即同一性％=相同位置的數目/位置總數X100)，同 時考慮空位的數目以及需要被引入以優化兩個或更多個序列的比對的各空位的長度。當在 使用確定參數（即確定的氨基酸取代矩陣、空位存在罰分（也稱為空位開放罰分）和空位 延伸罰分）以便獲得那對序列所可能的最高類似性評分下使兩個序列對準時，它們被最優 比對。
[0041]使用數學算法，如 BLAST 算法（例如 Altschul 等，J Mol. Biol. 215:403, 1990 ; 也參見在萬維網ncbi. nlm. nih. gov/BLAST處的BLASTN)實現用于確定兩個或更多個序 列之間的同一性百分比的"最優比對"。對于氨基酸序列，BL0SUM62矩陣（Henikoff和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (22) : 10916-10919)用作如 BLASTP 的氨基酸 序列比對算法中的缺省評分取代矩陣。施加空位存在罰分以在一個比對序列中引入單一 氨基酸空位，并且對空位中的各殘基位置施加空位延伸罰分。用以下比對參數使用BLASTP 來進行氨基酸序列的最優比對：BL0SUM62評分矩陣，空位存在罰分=11，以及空位延伸罰 分=1。對于核酸序列的最優比對，BLASTN與以下比對參數一起使用：匹配/錯配評分= 1/-3,以及空位存在罰分=5和空位延伸罰分=2。類似性評分通過各序列的開始和結束比 對所處的氨基酸或核苷酸位置（例如比對窗），以及任選通過向一個或兩個序列中插入一 個空位或多個空位以便獲得最高可能的類似性評分來確定。
[0042] "保守性取代"在本領域中被公認為一個氨基酸被取代成具有類似性質的另 一氨基酸。示例性保守性取代在本領域中是熟知的（參見例如1997年3月13日公布 的 WO 97/09433，第 10 頁；Lehninger, Biochemistry,第 2 版；Worth Publishers, Inc. NY:NY(1975),第 71-77 頁；Lewin, Genes IV，0xford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA(1990)，第 8 頁）。
[0043] 如本文所用，"過度表達"在關于核酸或蛋白質使用時是指所述核酸或蛋白質的表 達或活性增加。表達或活性增加包括核酸或蛋白質的表達或活性增加高于野生型（非遺傳 工程改造）對照或參照微生物的水平。如果表達或活性處于其中核酸或蛋白質通常不被表 達或不具有活性的微生物中，那么它過度表達。如果表達或活性在重組微生物中比在野生 型對照或參照微生物中延長或存在更長久，那么核酸或蛋白質過度表達。
[0044] 如本文所用的"抑制"或"被抑制"是指相對于對照、內源性或參照分子，在靶標基 因的表達方面或在靶標分子的活性方面直接或間接改變、降低、下調、廢除或缺失，其中所 述改變、降低、下調或廢除是統計、生物、工業或臨床顯著的。
[0045] 如本文所用，術語"衍生物"是指通過化學或生物手段（例如用或不用酶）達成的 化合物的修飾，所述修飾的化合物在結構上類似于母體化合物，并且（實際上或理論上）可 從那個母體化合物衍生。衍生物與母體化合物可具有不同化學、生物或物理性質，如相較于 母體化合物更具親水性或具有改變的反應性。衍生（即修飾）可涉及取代分子內的一個或 多個部分（例如官能團變化）。舉例來說，氫可被如氟或氯的鹵素取代，或羥基（-OH)可被 羧酸部分（-C00H)置換。其它示例性衍生包括聚合、糖基化、烷基化、酰化、乙酰化、泛素化、 酯化和酰胺化。
[0046] 術語"衍生物"也指母體化合物的所有溶劑合物（例如水合物或加合物（例如與 醇的加合物））、活性代謝物和鹽。鹽的類型取決于化合物內各部分的性質。舉例來說，如羧 酸基團的酸性基團可形成堿金屬鹽或堿土金屬鹽（例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽以及與在生 理上可耐受的季銨離子形成的鹽和與氨和在生理上可耐受的有機胺（例如像三乙胺、乙醇 胺或三-(2-羥乙基）胺）形成的酸加成鹽）。堿性基團可與例如無機酸（如鹽酸、硫酸或 磷酸）或與有機羧酸或磺酸（如乙酸、檸檬酸、乳酸、苯甲酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石 酸、甲烷磺酸或對甲苯磺酸）形成酸加成鹽。同時含有堿性基團和酸性基團（例如除堿性 氮原子之外也含有羧基）的化合物可以兩性離子形式存在。鹽可通過為本領域技術人員所 知的慣用方法，例如通過在溶劑或稀釋劑中組合化合物與無機或有機酸或堿，或通過陽離 子交換或陰離子交換由其它鹽獲得。
[0047] 如本文所用，術語"乳酸"是指所有形式的乳酸，包括所有衍生形式，如乳酸鹽、乳 酸離子、乳酸酯、乳酸溶劑合物和/或乳酸或乳酸酯的寡聚物。
[0048] 術語"表達控制序列"意指指導與其操作性地連接的核酸的轉錄的核酸序列，例如 像啟動子或增強子。
[0049] 術語"可操作地連接"在本文中是指以下構型：其中控制序列相對于外源性LDH編 碼核酸被適當放置在某一位置處以使所述控制序列影響編碼的LDH的表達。
[0050] 如本文所用，術語"相應的親本乳酸脫氫酶"是指天然存在的乳酸脫氫酶或LDH序 列變體的氨基酸序列所基于的另外已知的乳酸脫氫酶。
[0051] C1R謝微生物-宿主細胞
[0052] 通過將所需外源性LDH編碼核酸引入所需宿主細胞中來制備本發明的非天然存 在的C1代謝微生物。將被遺傳修飾的C 1代謝微生物可為天然菌株，被改適（例如進行發酵 以選擇相較于親本菌株，乳酸利用降低、生長速率提高或總生物質產量增加的菌株）或先 前被重組修飾以使烷烴或烯烴轉化成乳酸，具有降低或最小丙酮酸脫羧酶活性，具有增加 的生長速率或其任何組合的菌株。在某些優選的實施方案中，C 1代謝微生物不是光合微生 物，如藻類或植物。常常，本發明的C1代謝微生物不是酵母，并且通常不是真菌。在一些實 施方案中，本發明的C 1R謝微生物不是光合微生物或真菌。
[0053] 在某些實施方案中，本發明的C1代謝微生物是作為來自以下屬中的一個或多個 的遺傳修飾的細胞的原核生物或細菌：甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲