用于通過順序、自動提供葡萄糖分批補料發酵所供養的小球藻屬物種的方法
【專利說明】用于通過順序、自動提供葡萄糖分批補料發酵所供養的小 球藻屬物種的方法
[0001] 本發明涉及一種用于通過分批補料發酵生產小球藻屬微藻的新方法。
[0002] 現有技術的呈現
[0003] 在歷史上，藻類"只需水和陽光"來生長，因此藻類長期被認為是食物的來源。
[0004] 存在若干可用在食品中的藻類物種，大部分是"大型藻類"，例如海帶、海白菜（石 藥（Ulva Iactuca))和紫菜屬（在日本種植的）或紅皮藻（帕爾瑪利亞掌葉（Palmaria palmata))型紅藻。
[0005] 然而，除了這些大型藻類外，還存在由"微藻"代表的藻類的其他來源，也就是說經 種植用于在生物燃料或食品中應用的海產或非海產光合作用類或非光合作用單細胞微藻。
[0006] 例如，螺旋藻（鈍頂螺旋藻（Arthrospira platensis))是在開放泄湖中培養的 (在光養條件下），用作食品補充劑，或少量地摻于糖果或飲品中（一般不到〇. 5重量/重 量％ ) O
[0007] 其他富含脂質的微藻，包括屬于小球藻屬的某些物種，在亞洲國家作為食品增補 劑也非常受歡迎。
[0008] 使用可以被用于碳和能量代謝的葡萄糖或其他基于碳的底物，微藻的若干物種能 夠變光合自養生長（憑借光，該光提供能量用于轉化CO 2為基于碳的鏈）為異養生長（不 需要光）。
[0009] 當今工業上使用三種用于生產微藻的方法：
[0010]-在異養反應器中（完全封閉的）；
[0011] -在露天池中；
[0012] -在玻璃管中。
[0013] 由這些培養方法生產具有變量屬性和組合物的小球藻屬物種。這些組合物將根據 它們是否在光照中產生和是否在露天中產生而不同。
[0014] 小球藻屬型的微藻粉的生產和用途，例如，描述于文件W02010/120923和TO 2010/045368 中。
[0015] 微藻粉的油部分可基本上由單不飽和油構成，與常見于常規食品中的飽和、氫化 和多不飽和油相比，可提供營養及健康優勢。
[0016] 當期望從其生物質工業生產微藻粉粉末時，主要困難仍然不僅來自所生產組合物 的技術觀點，而且來自所生產組合物的感覺屬性的觀點。
[0017] 這是因為，當藻類粉末，例如用在露天池中或通過光生物反應器光合培養的藻類 所制造的藻類粉末，是可商購的時，它們具有深綠的顏色（與葉綠素有關）和強烈令人不快 的味道。
[0018] 因此事實上，普遍接受的是在異養培養條件下并且在黑暗中抑制葉綠體的形成和 生長。
[0019] 因此在這些異養條件下，微藻并不使用光合作用反應而是通過消耗培養基的糖來 生長。
[0020] 該生產系統的優勢為：
[0021] -按體積計極大地增加了的生產率，相對于開放系統的100倍，并且相對于生物反 應器的10倍，
[0022]-非常高濃度的干物質（數百克/升），
[0023] -低生產成本，
[0024] -所獲得的產物質量非常高，
[0025] -有限培養基并且因此無污染，
[0026] -不受地點約束，
[0027] -工業上非常容易操作，
[0028] -通過不同工業，例如化學工業和食品加工業，在工業規模上關于酵母菌和細菌的 技術已經完全掌握了幾十年，
[0029] -不存在葉綠素并且因此味道更中性。
[0030] 兩種形式的異養培養常規描述于文獻（例如，里士滿的H.巖本（Iwamoto)，A.編 輯，2004,微藻培養手冊（Handbook of Microalgal Culture)，布萊克威爾，牛津，255-263) 中。
[0031] H.巖本（Iwamoto)寫到，當以批次處理方式（在發酵起始時一次供應所有的葡萄 糖）控制異養培養階段時，指數生長的初始階段后是成熟期，以便獲得富含有利化合物的 細胞。
[0032] 在初始階段期間，伴隨著葡萄糖的消耗，生物質增加，并且在零葡萄糖時停止。
[0033] 隨后利用第二"成熟"階段，以便促進其他有利分子（色素、脂質、以及類似物）的 產生。
[0034] 通常在葡萄糖限制的條件下進行分批補料方式的培養（逐步用葡萄糖補料）。
[0035] 如由H.巖本（Iwamoto)所描述的，方法核心的原則涉及響應于由生長小球藻屬物 種的葡萄糖的消耗來提供葡萄糖。
[0036] 連續并自動分析培養基中葡萄糖的濃度，并且保持在1. 5%。
[0037] 當到達所希望的細胞密度時，停止葡萄糖補料。然后將培養保持在該狀態持續約 10小時，以便促進細胞成熟。
[0038] H.巖本（Iwamoto)用規則小球藻（Chlorella regularis)菌株解釋說明了在葡萄 糖限制的條件下分批補料培養方式的應用。
[0039] 培養進行總計40h的持續時間，第一個30小時致力于微藻的生長，并且用葡萄糖 供養它們。
[0040] 隨后的10小時致力于成熟，不提供葡萄糖。
[0041] 然后收集生物質并通過離心、洗滌、在130°C下熱滅活（該熱滅活使其可以抑制葉 綠素酶）3秒鐘來濃縮并且通過霧化干燥，以便獲得極細粉。
[0042] 然而，具體地，使用這種處理方式是為了再活化成熟期過程中葉綠素和類萌蘿卜 素的產生。
[0043] 它并不適用于富含脂質的小球藻屬生物質的生產，該小球藻屬生物質不具有造成 感官品質不利影響的缺點（異味），并且特別是不產生葉綠素。
[0044] 此外，用于測定剩余葡萄糖的自動裝置并不夠可靠，并且并沒有給出足夠快速的 應答（>1分鐘），以允許精確調節發酵。
[0045] 因此，仍然存在對可供用于通過分批補料發酵進行有效生產的方法的未滿足的需 求，該分批補料發酵不受剩余葡萄糖管理的約束。
[0046] 發明概述
[0047] 本申請公司已經發現，通過提供一種用于通過分批補料發酵生產小球藻屬微藻的 方法可以滿足該需要，其中在完全特定條件下碳基源的添加是順序的并且是自動的，也就 是說通過順序添加來供應碳基源以控制發酵培養基的溶解氧壓力（PO 2)值。
[0048] 因此，本發明涉及用于通過分批補料發酵生產小球藻屬微藻的方法，該方法特征 在于響應于微藻氧消耗的下降來順序并自動進行碳基源的供應。
[0049] 該微藻可以選自下組，該組由以下各項組成：原殼小球藻（Chlorella protothecoides)、耐熱性小球藻（Chlorella sorokiniana)和普通小球藻（Chlorella vulgaris)。優選地，該微藻是原殼小球藻。
[0050] 該碳基源可以是適合于通過發酵培養微藻的任何碳源。其具體可以選自下組，該 組由以下各項組成：葡萄糖、乙酸酯和乙醇、以及這些的混合物。優選地，碳基源是葡萄糖。
[0051] 可以通過測量培養基中的溶解氧壓力來檢測微藻的耗氧量的下降。因為該壓力的 增加反映了消耗的下降，當發酵培養基中溶解氧壓力（PO 2)超過閾值時，可以觸發碳基源的 供應。
[0052] 該閾值可以是從1 %至100 %的pO^，優選的是從1 %至80 %，更優選的是從1 % 至20%，仍更優選的是從10%至20%，當不限制發酵培養基中碳基源的濃度時，大于發酵 培養基中的P〇2。
[0053] 優選地，當不限制發酵培養基中碳基源的濃度時，形成的p02值是從20%至40%， 并且更具體優選的是約30%。
[0054] 優選地，已經完全消耗碳基源的時刻與供應碳基源的時刻之間的時間段為小于5 分鐘，更具體優選的是小于1分鐘。
[0055] 剩余的碳源優選永久地保持，或幾乎永久地保持在大于0并小于20g/l的值，優選 的是小于l〇g/l。
[0056] 優選地，借助栗進行碳基源供應，該碳基源供應的最大流速使得可以在少于10分 鐘內向發酵培養基添加從10至20g/l的碳基源。