共交聯磷酸鹽化的和/或磷酸鹽官能化的聚多糖類水凝膠的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基于透明質酸的水凝膠領域。特別地，本發明涉及通過透明質酸與葡 聚糖的共交聯獲得的磷酸化水凝膠，及其制備方法。本發明還涉及所述水凝膠用于活性成 分和細胞的封裝和緩釋的用途，所述活性成分和細胞用于人類和獸醫再生醫學。
【背景技術】
[0002] 玻尿酸或透明質酸（CAS No. 9004-61-9,在本文中也縮寫為HA)屬于粘多糖家族。 其為二糖聚合物，更具體地為線性非硫酸化粘多糖，其中包含通過交替的β_1，4和β-1，3 糖苷鍵結合在一起的葡萄糖醛和N-乙酰基-D-葡糖胺D-酸的重復單元（參見Tammi 等人在 Progress in Histochemistry&Cytochemistry 雜志上發表的文南犬"Hyaluronan metabolism in skin"，29 (2): 1-81，1994)。
[0003] 透明質酸發現于許多哺乳動物的組織中，更具體地在細胞外組織基質中。由于其 結合水分子的能力，其主要作用是組織的水合作用。如果其分子量超過約2MDa并且其質量 分數超過約0. 1 %，其會形成水凝膠；根據其分子量和質量分數，它以這種形式存在于某些 組織中，例如關節中，尤其是關節滑液中。它還具有其它作用，例如對諸如細胞迀移、組織分 化、血管再生和免疫細胞調節等生物現象的調節作用。因此，現有技術基于其分子量將該分 子歸于完全不同的功能。
[0004] 透明質酸在體內經一組酶（稱為透明質酸酶）分解（參見K. S. Girish和 K. Kemparaju 在 Life Sciences 雜志上發表的文章 "The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase:A biological overview"，80(2007 年），ρ· 1921 至 1943);也有其 它酶參與這一過程。
[0005] 基于透明質酸的水凝膠是已知的，并且用于很多醫療應用中，特別是以注射形式 用于皮膚重建、美容外科及皮膚科、或者用于軟骨和骨關節的重建的矯形術（例如，用于膝 關節的粘彈性補充治療）。它們也可以用作細胞培養基用于研究和細胞治療，或者用于化學 治療。
[0006] 根據其制備方法和用途，基于透明質酸的可注射的水凝膠可以分為三種不同的類 別：
[0007] - "導電"水凝膠，包含單獨的交聯透明質酸（HA)或者與其它聚合物結合的透明質 酸，用于在整容手術或粘彈性補充治療（體內平衡的恢復）中填充皺紋；
[0008] - "誘導"水凝膠，包含交聯透明質酸，含有生長因子和/或其它所謂的生物活性分 子，用于在原位傳遞中控制它們；
[0009] -用于細胞移植的水凝膠，由多種組分構成：聚合物、蛋白質和細胞。
[0010] 對于人類醫學或獸醫學的用處，水凝膠必須滿足多種標準（參見Μ. Ν. Collins和 C. Birkinshaw發表的文章 "Hyaluronic acid base scaffolds for tissue engineering-A review"，Carbohydrate Polymers 92 (2013)，1262-1279, 2013 ;GD Prestwich 發表的文 章 "Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine'，，J. Controlled Release 155 (2011)，193-199) 〇 例 如，水凝膠必須是可生物降解的、生物相容的以及可再吸收的；而且它必須易于在生理條件 下使用。
[0011] 通常，術語"生物相容性"是指非生物材料與生物系統相互作用的這樣一種能力， 要求其通過對宿主具有適當的反應以滿足特定功能。
[0012] 長期以來膠原蛋白（糖蛋白家族）被用作可再吸收的、可注射的填充物。然而，膠 原蛋白存在某些缺點，包括出現過敏反應、以及在體內快速降解的風險。
[0013] 這些都是其被透明質酸鹽替代的原因，無論其來源和制備方法（動物、生物技 術），透明質酸鹽沒有任何過敏反應并且是生物相容的。
[0014] 當前，透明質酸水凝膠，特別是其鹽和/或衍生物，已廣泛應用于化妝品領域，特 別是用于填充皺紋和皮膚缺損。
[0015] 透明質酸及其鹽可以單獨用于水凝膠的制備，也可以與其它聚合物（膠原蛋白、 明膠、殼聚糖、硫酸軟骨素等等）組合使用，以促進不同組分的協同作用，并且更可靠地模 擬細胞外基質。
[0016] 由于沿著所述鏈存在的羧基、羥基和乙酰胺官能團，透明質酸可以經化學改性。一 方面，這些基團可以用于交聯；另一方面，這些基團也可以用于官能化，以提供新的生物性 能或改善固有的生物和/或物理化學性質。交聯涉及兩個多糖鏈之間和/或同一個鏈的兩 個部分之間鍵的形成。其導致粘度和/或分子量增加，并且驅動其它物理和物理化學性質 的改性。
[0017] 因此，由透明質酸制備水凝膠具有多種可能性。
[0018] 文獻FR 2918377描述了一種粘性共交聯凝膠，其包含至少一個第一強交聯多糖 凝膠、和至少一個第二弱交聯多糖凝膠，所述第一凝膠通過共價鍵與第二凝膠結合。強交聯 凝膠和弱交聯凝膠優選地基于透明質酸鈉；交聯劑為1，4- 丁二醇二縮水甘油醚（BDDE)。
[0019] 文獻US 6586493描述了一種水凝膠，其得自包含部分不飽和多糖和非-血管生成 透明質酸的混合物，所述部分不飽和多糖被交聯基團取代。所述混合物的交聯是通過加入 自由基聚合引發劑（特別是苯乙酮（光引發劑））實現的。由于自由基聚合產生的大量降 解產物一旦形成就可能被限制在生成的水凝膠中，因此這個過程是非常不利的。
[0020] 本發明的目的是提供一種新的基于多糖的水凝膠，其對增加的降解具有良好的抵 抗性并且沒有細胞毒性，對于美容外科、皮膚科、眼科、骨科用于軟骨和骨關節重建、以及人 類和獸醫再生醫學的用途而言，其是可注射的并且是生物相容的。
【發明內容】
[0021] 本發明涉及共交聯的磷酸化多糖水凝膠，基于（i)葡聚糖和（ii)透明質酸和/或 其鹽，任選地官能化的透明質酸和/或其鹽，在水凝膠中所述葡聚糖和所述透明質酸（和/ 或其鹽，任選地官能化的透明質酸和/或其鹽）通過磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共價鍵結 合在一起。
[0022] 有利的是，透明質酸或其鹽，為由三偏磷酸鈉官能化的磷酰基透明質酸（和/或其 鹽）。
[0023] 在本發明一個特定的實施方案中，三偏磷酸鈉官能化的透明質酸（和/或其鹽） 中磷酸鹽的濃度介于0.0 lmEq/g至4mEq/g，更優選地介于0.1 mEq/g至2mEq/g。
[0024] 在本發明另一個實施方案中，水凝膠中磷酸鹽的濃度介于0.1 mEq/g至3mEq/g，更 優選地介于〇· ImEq/g至2mEq/g。
[0025] 本發明還涉及一種制備基于葡聚糖和透明質酸的共交聯的磷酸化多糖水凝膠和/ 或其鹽（任選地官能化的）的方法，其中：
[0026] a)提供葡聚糖溶液；
[0027] b)通過向所述葡聚糖溶液中加入堿金屬氫氧化物溶液（例如氫氧化鈉），使得該 葡聚糖中的至少一個羥基被激活，從而得到活化的葡聚糖溶液；
[0028] c)向所述活化的葡聚糖溶液中加入三偏磷酸鈉；
[0029] d)向步驟c)中獲得的溶液中加入透明質酸和/或其鹽，任選地官能化的透明質酸 和/或其鹽。
[0030] 有利的是，同時進行該方法的步驟c)和d)，將三偏磷酸鈉和透明質酸（和/或其 一種鹽，任選地官能化的）同時添加至該方法步驟b)中獲得的溶液中。
[0031] 有利的是，在18至25°C的溫度下實施所述方法的步驟a)至d)。
[0032] 在該方法一個特定的實施方案中，步驟b)中加入的堿金屬氫氧化物的濃度介于 0.1 M至IM之間，優選地介于0.1 M至0. 5M之間。
[0033] 在該方法另一個特定的實施方案中，該方法步驟d)中加入的透明質酸和/或其鹽 為用三偏磷酸鈉官能化的透明質酸。
[0034] 有利的是，以粉末的形式添加透明質酸和/或其鹽（任選地官能化的）。
[0035] 本發明還涉及用于制備藥物的本發明水凝膠，以及能夠通過本發明方法制得的水 凝膠，將單獨植入或與細胞（任選的干細胞）一起用于細胞療法；或者將以濕形式用于局部 應用中；或者將用于運送活性分子和活性成分，以及更具體的生長因子，優選的生長因子選 自：成纖維細胞生長因子（FGFs)、血小板源性生長因子（PDGFs)、轉化生長因子（TGFs)，血 管內皮生長因子（vEGF)，骨誘導生長因子（BMPs);或者將用于再生醫學中，并且更具體地 用于人類和/或獸醫再生醫學。
[0036] 本發明的最終目的是本發明水凝膠用于骨傳導和/或骨誘導的用途，即其用于骨 再生的用途。
【附圖說明】
[0037] 圖1至8闡明了本發明的某些方面。
[0038] 圖1為紅外光譜（IR)，其示出本發明方法（實施例1)中的反應混合物在25°C下 從同時添加透明質酸和三偏磷酸鈉 TMP開始24小時內的紅外曲線的變化（曲線a :添加后 22分鐘；曲線b :添加后32分鐘；曲線c :添加后42分鐘；曲線d :添加后52分鐘；曲線e : 添加后120分鐘；曲線f :添加后24小時得到的凝膠）。X軸表示波數，以cm 1為單位；y軸 表示透過率（以％表示，無量綱）。
[0039] 圖2的圖表示出堿金屬氫氧化物的濃度和三偏磷酸鈉的濃度對葡聚糖交聯的影 響。
[0040] 圖3為根據本發明制