I型干擾素的環(huán)狀二核苷酸誘導(dǎo)的制作方法
【專利說明】I型干擾素的環(huán)狀二核苷酸誘導(dǎo)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 在35 U.S.C. § 119(e)下，本申請要求于2013年5月3日提交的美國臨時專利申 請序列號61/819, 499的提交日期的優(yōu)先權(quán)；該申請的公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 政府權(quán)利
[0004] 本發(fā)明在由美國國立衛(wèi)生研究院資助的基金號AI063302、AI075038、AI080749、 AI082357和0D008677下經(jīng)政府支持下完成。政府在本發(fā)明中享有一些權(quán)利。
[0005] 引言
[0006] 干擾素（也稱為"IFN"）是具有多種生物學活性的蛋白質(zhì)，其中一些是抗病毒、免 疫調(diào)節(jié)和抗增殖。它們相對較小的物種特異的單鏈多肽，由哺乳動物應(yīng)答暴露于多種誘導(dǎo) 物例如病毒、多肽、促分裂原等而產(chǎn)生。干擾素保護動物組織和細胞免受病毒攻擊，并且是 重要的宿主防御機制。在大多數(shù)情況下，與其他組織和細胞類型相比，干擾素提供了對產(chǎn)生 它們的組織和細胞類型的更好的保護，這說明來源于人的干擾素可比來自其他物種的干擾 素更有效地治療人疾病。干擾素可分為I型干擾素、II型干擾素和III型干擾素。哺乳動 物 I 型干擾素包括 IFN- a、IFN- β、IFN- κ、IFN- δ、IFN- ε、IFN- τ、IFN- ω 和 IFN- ζ (也 稱為限制素，limtin)。
[0007] 誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的試劑可用作疫苗佐劑，以及用于啟動效應(yīng)T細胞應(yīng)答和記憶T 細胞應(yīng)答的制劑。有效的佐劑增強針對抗原的特異性免疫應(yīng)答，同時最小化毒副作用，降低 疫苗接種的次數(shù)和劑量，并且擴展免疫應(yīng)答。仍然存在對這樣的有效佐劑的需要，所述佐劑 可與來源于細胞內(nèi)病原體和癌細胞的抗原共配制以活化有效的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫 應(yīng)答，從而治療細胞內(nèi)病原體以及降低腫瘤負荷。干擾素蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性和調(diào)控干擾 素產(chǎn)生的信號通路作為用于設(shè)計新佐劑的標靶吸引了興趣。
[0008] 干擾素具有治療很多人癌癥的潛力，因為這些分子具有在多重水平起作用的抗癌 活性。首先，干擾素蛋白可直接抑制人腫瘤細胞的增殖。該抗增殖活性還與多種批準的化療 劑協(xié)調(diào)，例如，順鉑、5FU和紫杉醇。其次，干擾素蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性可導(dǎo)致誘導(dǎo)抗腫瘤免 疫應(yīng)答。該應(yīng)答包括活化NK細胞、刺激巨噬細胞活性和誘導(dǎo)MHC I型表面表達，導(dǎo)致誘導(dǎo) 抗腫瘤細胞毒性T淋巴細胞活性。此外，在免疫系統(tǒng)中干擾素起交叉呈遞抗原的作用。此 外，一些研究還顯示，IFN-β蛋白可具有抗血管生成性活性。血管發(fā)生、新血管形成是固體 腫瘤生長的臨界點。有證據(jù)顯示，IFN-β可通過抑制原血管生成性因子例如bFGF和VEGF 的表達來抑制血管發(fā)生。最后，干擾素蛋白可通過調(diào)節(jié)在組織重塑方面重要的酶例如膠原 酶和彈性酶的表達來抑制腫瘤侵襲性。
[0009] 干擾素還表現(xiàn)出具有基于兩種不同機制的抗病毒活性。例如，I型干擾素蛋白（α 和β)可直接抑制人乙肝病毒（"HBV"）和丙肝病毒（"HCV"）的復(fù)制，并且還可刺激攻擊 被這些病毒感染的細胞的免疫應(yīng)答。
[0010] 概述
[0011] 本發(fā)明提供了用于提高細胞中的I型干擾素（IFN)的產(chǎn)生的方法和組合物。所述 方法的方面包括以足以提高細胞產(chǎn)生所述I型干擾素（IFN)的方式提高所述細胞中的包含 2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的水平。還提供了用于實施該主題方法的組合物和藥 劑盒。
[0012] 在一個方面中，本文提供了一種用于提高細胞中I型干擾素（IFN)的產(chǎn)生的方法， 這通過以足以提高細胞產(chǎn)生所述I型干擾素（IFN)的方式提高所述細胞中的包含2' -5' 磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的水平來進行。
[0013] 在某些實施方案中，所述方法包括使所述細胞與所述環(huán)狀二核苷酸接觸的步驟。 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有兩個2' -5'磷酸二酯鍵。在另一些實施方案 中，所述環(huán)狀二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯鍵和3' -5'磷酸二酯鍵。
[0014] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含鳥苷核苷酸。在一些實施方案中，所述 環(huán)狀二核苷酸包含兩個鳥苷。在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含腺苷核苷酸。在 一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個腺苷。在另一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷 酸包含腺苷核苷酸和鳥苷核苷酸。
[0015] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0017] 其中X和Y分別是：
[0019] 在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0020]
[0021] 在所述方法的某些實施方案中，通過提高所述細胞中的cGAMP合酶（cGAS)的活性 來提高所述環(huán)狀二核苷酸的水平。在一些實施方案中，通過增強編碼cGAS的核酸的表達來 提高所述cGAS的活性。在一些實施方案中，通過將編碼cGAS的核酸引入所述細胞中來提 高所述cGAS的活性。
[0022] 在某些實施方案中，所述方法用于提高干擾素（IFN) α的產(chǎn)生。在另一些實施方 案中，所述IFN是干擾素 β。
[0023] 在某些實施方案中，所述方法用于提高哺乳動物細胞中的I型干擾素（IFN)的產(chǎn) 生。在一些具體實施方案中，哺乳動物細胞是人細胞。在一些實施方案中，所述細胞是體外 的。在另一些實施方案中，所述細胞是體內(nèi)的。
[0024] 在另一個方面中，本文提供了用于提高受試者中I型干擾素（IFN)的產(chǎn)生方法，所 述方法包括將有效提高所述受試者中的所述I型干擾素的產(chǎn)生的量的包含2' -5'磷酸二 酯鍵的環(huán)狀二核苷酸活性劑施用至受試者的步驟。
[0025] 所述活性劑可包括但不限于本文描述的任何包含W -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二 核苷酸。在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有兩個W -5'磷酸二酯鍵。在另一些 實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯鍵和3' -5'磷酸二酯鍵。
[0026] 在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含鳥苷核苷酸。在某些實施方案中，所述 環(huán)狀二核苷酸包含兩個鳥苷。在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一 些具體實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個腺苷。在另一些實施方案中，所述環(huán)狀二核 苷酸包含腺苷核苷酸和鳥苷核苷酸。在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0028] 其中X和Y分別是：
[0030] 在主題方法的一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0032] 在某些實施方案中，所述包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸活性劑是提高 cGAMP合酶（cGAS)的細胞活性的藥劑。在一些具體實施方案中，所述藥劑包含編碼所述 cGAS的核酸。
[0033] 在某些實施方案中，所述方法用于提高受試者中干擾素（IFN) α的產(chǎn)生。在另一 些實施方案中，所述方法用于提高受試者中干擾素 β的產(chǎn)生。
[0034] 在某些實施方案中，所述對象患有病毒性感染。在某些實施方案中，所述對象患有 細菌性感染。在另一些實施方案中，所述對象患有腫瘤性疾病。在某些實施方案中，所述受 試者是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。
[0035] 在另一個方面中，本文提供了一種用于提高受試者中干擾素基因（STING)的刺激 物介導(dǎo)的應(yīng)答的方法，所述方法包括將有效提高所述受試者中STING介導(dǎo)的應(yīng)答的量的 STING活性劑施用至所述受試者。在某些實施方案中，所述STING介導(dǎo)的應(yīng)答是對具有兩個 3' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸無應(yīng)答性。
[0036] 所述STING活性劑可包括但不限于本文描述的任何包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán) 狀二核苷酸。在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有兩個2' -5'磷酸二酯鍵。在另 一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯鍵和3' -5'磷酸二酯鍵。
[0037] 在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含鳥苷核苷酸。在某些實施方案中，所述 環(huán)狀二核苷酸包含兩個鳥苷。在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一 些具體實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個腺苷。在另一些實施方案中，所述環(huán)狀二核 苷酸包含腺苷核苷酸和鳥苷核苷酸。在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0039] 其中X和Y分別是：
[0041] 在主題方法的一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0043] 在某些實施方案中，所述STING活性劑包含提高cGAMP合酶（cGAS)的細胞活性的 藥劑。在一些具體實施方案中，所述藥劑包含編碼所述cGAS的核酸。
[0044] 在某些實施方案中，所述STING活性劑包含提高STING的細胞活性的藥劑。在一 些具體實施方案中，所述藥劑包含編碼所述STING的核酸。
[0045] 在某些實施方案中，所述對象患有病毒性感染。在某些實施方案中，所述對象患有 細菌性感染。在另一些實施方案中，所述對象患有腫瘤性疾病。在某些實施方案中，所述受 試者是哺乳動物。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。
[0046] 在另一個方面中，本文提供了一種環(huán)狀二核苷酸，其包含2' -5'磷酸二酯鍵。這 樣的環(huán)狀二核苷酸可用于例如實施主題方法，包括但不限于用于提高細胞或受試者中I型 干擾素的產(chǎn)生的方法。
[0047] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有兩個2' -5'磷酸二酯鍵。在另一些 實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯鍵和3' -5'磷酸二酯鍵。
[0048] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含鳥苷核苷酸。在一些實施方案中，所述 環(huán)狀二核苷酸包含兩個鳥苷。在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含腺苷核苷酸。在 一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個腺苷。在另一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷 酸包含腺苷核苷酸和鳥苷核苷酸。
[0049] 在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0051] 其中X和Y分別是：
[0053] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0054]
[0055] 在另一個方面中，本文提供了一種組合物，其包含包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán) 狀二核苷酸和藥學上可接受的載體。
[0056] 在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有兩個2' -5'磷酸二酯鍵。在另一些 實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有2' -5'磷酸二酯鍵和3' -5'磷酸二酯鍵。
[0057] 在某些組合物的實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含鳥苷核苷酸。在一些實施方 案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個鳥苷。在某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含腺苷核 苷酸。在一些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸包含兩個腺苷。在另一些實施方案中，所述環(huán) 狀二核苷酸包含腺苷核苷酸和鳥苷核苷酸。
[0058] 在主題組合物的某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0060] 其中X和Y分別是：
[0061]
[0062] 在主題組合物的某些實施方案中，所述環(huán)狀二核苷酸具有以下式：
[0064] 附圖簡述
[0065]當結(jié)合附圖來閱讀時，本發(fā)明將從以下詳細描述中得到最佳理解。強調(diào)的是，按照 慣例，附圖的多個特征不是按比例的。相反，為了清楚，任意擴展或縮小多個特征的尺寸。附 圖中包括以下圖：
[0066] 圖IA至IF示出了人STING變體對映射至精氨酸232的環(huán)狀二核苷酸的可變應(yīng)答 性。㈧用編碼靶向STING的shRNA或?qū)φ誷hRNA的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)THP-I細胞。然后用環(huán)狀二 GMP (cdG)、dsDNA、環(huán)狀二AMP (cdA)、多肌苷：胞嘧啶（pi: C)或仙臺病毒刺激細胞，并通過 定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR來評估人干擾素 -β mRNA的誘導(dǎo)。（B)蛋白質(zhì)印跡確認STING的敲除有 效。（C)用指定量的多種小鼠（m)或人（h) STING表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，然后在6小 時后通過用合成的cdG(5yM)轉(zhuǎn)染來刺激該細胞。GT表示來自Goldenticket(Gt)小鼠的 Sting的空I199N等位基因。通過使用共轉(zhuǎn)染的IFN熒光素酶報告子構(gòu)建體來評估STING 活化。（D)用編碼所指定的STING等位基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Gt (空STING)巨噬細 胞，然后在48小時后通過用cdG (5 μ M)或dsDNA 70聚體的寡核苷酸（0. 5 μ g/mL)刺激該 細胞。通過qRT-PCR測量IFN誘導(dǎo)。ND，未檢出。伍)311如與32?-環(huán)狀二61^的結(jié)合測 定。將STING蛋白表達于HEK293T細胞中，并使細胞裂解物經(jīng)歷與 32P-CdG的UV交聯(lián)，并通 過SDS-PAGE解析。通過放射自顯影來對結(jié)合進行定量。以抗STING多克隆抗體進行的對 細胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡確認多種STING蛋白的相似表達。（F)mSTING對cGAMP的應(yīng)答性 受到R231突變的影響。如在C中那樣測試所指定的突變體。
[0067] 圖2示出了 hSTING變體的序列對齊。從THP-I細胞克隆hSTING，與參照STING等 位基因 （NCBI NP_938023. 1)對比。
[0068] 圖3示出，環(huán)狀二GMP的應(yīng)答性需要人STING的R232,但環(huán)狀二GMP的結(jié)合不需 要。㈧用所指定小鼠（m) STING或人（h) STING等位基因轉(zhuǎn)染293T細胞，然后用環(huán)狀二 GMP(cdG)刺激該細胞。通過誘導(dǎo)共轉(zhuǎn)染的IFN-熒光素酶報告子構(gòu)建體來檢測STING活性， 并將該活性表示為相對于未經(jīng)刺激的細胞的熒光素酶活性的誘導(dǎo)倍數(shù)。（B)在α 32P-環(huán)狀 二GMP的存在下對經(jīng)轉(zhuǎn)染的293Τ細胞的裂解物進行UV交聯(lián)，通過SDS-PAGE進行解析，然 后通過放射自顯影來分析。還對裂解物進行針對STING和作為平行表達對照的ACTIN的蛋 白質(zhì)印跡。
[0069] 圖4示出，對環(huán)狀二核苷酸的最優(yōu)應(yīng)答性需要G230A和H232R二者，但對環(huán)狀二核 苷酸的結(jié)合不需要。（Α，Β)用所指定小鼠（m) STING或人（h) STING的等位基因轉(zhuǎn)染293Τ細 胞，然后用環(huán)狀二GMP(cdG)刺激該細胞。通過誘導(dǎo)共轉(zhuǎn)染的IFN-熒光素酶報告子構(gòu)建體 來檢測STING活性。
[0070] 圖5示出，STING變體對cGAS有應(yīng)答。（A)用所指定的STING等位基因以及用所 指定的人cGAS和小鼠 cGAS (wt和GS>AA突變體）轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。通過共轉(zhuǎn)染的IFN 熒光素酶報告子構(gòu)建體來評估STING活化。（B)用所指定的STING等位基因以及用編碼來 自霍亂弧菌（V. cholerae)的cGAMP合酶（DncV)的哺乳動物表達載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。 如A中一樣評估STING活化。（C)將rWspR、rDncV和rcGAS的體外酶促生成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至 經(jīng)毛地黃皂苷通透的表達所指定的小鼠 STING蛋白和人STING蛋白的HEK293T細胞中。包 括作為對照的化學合成的環(huán)狀二GMP (cdG)和cGAMP。如A和B中一樣評估STING活化。
[0071] 圖6示出，cGAS產(chǎn)生包含W -5'磷酸二酯鍵的非標準環(huán)狀二核苷酸。（A)將純 化的重組WspR、DncV和cGAS與a 32P-GTP或a 32P-ATP和所指定的未經(jīng)標記的核苷酸混合。 將反應(yīng)物與TLC電泳緩沖劑混合，并在PEI-纖維素 TLC板上解析核酸物質(zhì)。（B)用核酸酶 Pl和蛇毒磷酸二酯酶消化經(jīng)a 32P-GTP標記的WspR、DncV和cGAS產(chǎn)物，并且在PEI-纖維 素 TLC板上解析核酸物質(zhì)。（C)在600MHz和50°C下得到HPLC純化的cGAS產(chǎn)物的1H-31P HMBC。指定了磷酸二酯鍵的通過-結(jié)合的關(guān)鍵相關(guān)性。還示出了 cGAS產(chǎn)物的NMR顯示的 結(jié)構(gòu)。
[0072] 圖7A至7D提供了對cGAS產(chǎn)物的附加 NMR分析。所有數(shù)據(jù)采集都在D20中和50 °C 下進行。（A，B)900MHz場中的多重性編輯的1H-13CHSQC實驗。與次甲基和甲基質(zhì)子對應(yīng) 的正相信號以綠色示出，與亞甲基質(zhì)子對應(yīng)的負相信號以藍色示出。（C) 600MHz場中的1H-1H COSY 實驗。（D) 900MHz 場中的 1H-1H NOESY 實驗。
[0073] 詳述
[0074] 本發(fā)明提供了用于提高細胞中的I型干擾素（IFN)的產(chǎn)生的方法和組合物。所述 方法的方面包括以足以提高細胞產(chǎn)生所述I型干擾素（IFN)的方式提高所述細胞中的包含 2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的水平。還提供了用于實施該主題方法的實施方案的 組合物和藥劑盒。
[0075] 在更詳細描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所描述的特定實施方案，因為這 些當然是可變化的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定的實施方案，并非旨在限 制，因為本發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求書的限制。
[0076] 在提供值的范圍的情況下，應(yīng)理解，除非上下文清楚地另有說明，否則該范圍上限 與下限的每個中間值以及指定范圍中的任何其他指定值或中間值，直至下限的十分之一單 位，都涵蓋與本發(fā)明內(nèi)。較小的范圍中可獨立地包括這些較小范圍的上限和下限，并且這 些上限和下限將涵蓋于本發(fā)明內(nèi)，受到所陳述范圍中的任何具體排除的限值。在所陳述的 范圍包括一個或兩個該限值的情況下，本發(fā)明中包括排除所包括的限值之一或這二者的范 圍。
[0077] 在本文中某些范圍是以在數(shù)值前加術(shù)語"約"來呈示的。本文中使用術(shù)語"約"以 提供對其后面的精確數(shù)字以及其后面的數(shù)字的附近或近似該數(shù)字的數(shù)字提供字面支持。在 確定數(shù)字是否在具體列舉的數(shù)字附近或近似該數(shù)字中，接近或近似的所列舉的數(shù)字可為在 示出其的上下文中提供具體列舉的數(shù)字的基本等價物的數(shù)字。
[0078] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語都具有與由本發(fā)明所屬 領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解相同的含義。雖然與本文描述的方法和材料相似或等價的任何 方法和材料都可用于本發(fā)明的實施或測試中，但是現(xiàn)在描述代表性的示例性方法和材料。
[0079] 本說明書中引用的所有出版物和專利都通過引用并入本文，就如將每個單獨的出 版物或?qū)＠貏e地和單獨地指定為通過引用并入一樣，并且所有出版物和專利都通過引用 并入本文以結(jié)合所引用的出版物來公開和描述方法和/或材料。對任何出版物的引用都是 針對其在提交日期之前的公開內(nèi)容，并且其不應(yīng)解釋為承認由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不享 有先于該出版物的權(quán)利。此外，提供的出版物的日期可能與實際的公開日期不同，這可需要 進行單獨地確認。
[0080] 應(yīng)注意，除非上下文另有清楚指明，否則本文以及所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形 式"一個"、"一種"和"該/所述"包括復(fù)數(shù)指示物。還應(yīng)注意，可撰寫權(quán)利要求書來排除任 何可選要素。同樣地，該陳述旨在用作與權(quán)利要求要素的列舉聯(lián)合使用此類排他性術(shù)語如 "單獨"、"僅僅"等、或使用"否定"限制的在線基礎(chǔ)。
[0081] 在閱讀本公開后，對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見的是，本文描述和示出的每一個 單獨的實施方案具有單獨的組分和特征，該組分和特征可與任何其他一些實施方案的特征 分離或組合，而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。任何列舉的方法可按所列舉的事件的順序或 以邏輯可行的任何其他順序進行。
[0082] 方法
[0083] 如上文所概括，提供了提高細胞中I型干擾素（IFN)的產(chǎn)生（例如在體外或體內(nèi)） 的方法。提高I型干擾素的產(chǎn)生是指，與對照相比，主題方法提高了細胞中I型干擾素的產(chǎn) 生。該提高的量級可變化，并且在一些例子中為，與合適的對照相比，2倍或更大，例如5倍 或更大，包括10倍或更大。同樣，在一些例子中，所述方法是與合適的對照相比，將細胞中I 型干擾素的產(chǎn)生提高2倍或更大的量級，例如5倍或更大，包括10倍或更大。在實施所述 方法之前檢測不到干擾素的產(chǎn)生的一些實施方案中，該提高可導(dǎo)致可檢測的量的干擾素產(chǎn) 生?？赏ㄟ^使用任何合適的方法來測量干擾素產(chǎn)生，包括但不限于，水皰性口炎病毒（VSV) 激發(fā)生物測定、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、基于復(fù)制子的生物測定或通過使用在I型干擾 素信號通路的調(diào)控下克隆的報告基因（例如，熒光素酶）。參見例如Meager J. Immunol. Methods 261:21-36(2002) ;Vrolijk 等 C.J.Virol.Methods 110:201-209(2003);和 Francois 等 Antimicrob Agents Chemother 49 (9):3770-3775 (2005)〇
[0084] 所述方法可用于提高任何I型干擾素的產(chǎn)生，包含但不限于：IFN_a、IFN-β、 IFN- κ、IFN- δ、IFN- ε、IFN- τ、IFN-ω 和 IFN- ζ (也稱為限制素，limtin)。在一些實 施方案中，所述方法是用來提高IFN-a的產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述方法是用來提高 IFN- β 〇
[0085] 所述方法的方面包括以足以提高細胞產(chǎn)生所述I型干擾素的方式提高所述細胞 中的包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的水平。提高包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán) 狀二核苷酸是指，與對照相比，主題方法提高了包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸 的量。如在下面的實驗部分中示出，包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸可提高I型 干擾素產(chǎn)生的水平。該提高的量級可變化，并且在一些例子中為，與合適的對照相比，2倍或 更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50 倍或100倍。
[0086] 可使用多種不同的方法來實現(xiàn)提高包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的 水平。在一些例子中，所述方法包括提供具有提高靶細胞中包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán) 狀二核苷酸水平的環(huán)狀二核苷酸活性劑的靶細胞。環(huán)狀二核苷酸活性劑可變化，并包括但 不限于：小分子、核酸、蛋白質(zhì)和肽試劑。
[0087] 在一些實施方案中，與沒有與所述環(huán)狀二核苷酸活性劑接觸的對照相比，所述 環(huán)狀二核苷酸活性劑提高細胞或受試者中的IFN-a、IFN-β、IFN-K、IFN-δ、IFN- ε、 IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ (也稱為限制素，limtin)。在一些這樣的實施方案中，所述提高 為1. 5倍提高至50倍提高或更高，包括2倍提高至45倍提高、5倍提高至40倍提高、10倍 提高至35倍提高、15倍提高至30倍提高、20倍提高至30倍提高等。
[0088] 在一些例子中，所述環(huán)狀二核苷酸活性劑是包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核 苷酸或其功能類似物。包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸包括但不限于本文描述的 那些包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸。
[0089] 本文所用的"環(huán)狀二核苷酸"是指包含兩個核酸的化合物（即，第一核苷酸和第 二核苷酸），其中每個核苷酸的2'碳或3'碳通過磷酸二酯鍵與另一核苷酸的5'碳連 接。因此，包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸是指這樣的環(huán)狀二核苷酸，其中至少第 一核苷酸或第二核苷酸的2'碳與另一核苷酸的5'碳連接。下文中更詳細地描述了包含 2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸。
[0090] 包含2' -5'磷酸二酯鍵的環(huán)狀二核苷酸的功能類似物是表現(xiàn)出相似的功能活 性（例如，提高I型IFN的產(chǎn)生）的那些化合物，并且可具有與包含2' -5'磷酸二酯鍵的 環(huán)狀二核苷酸相似的結(jié)構(gòu)。在一些例子中，所述功能類似物是小分子試劑。所關(guān)注的天然 存在的或合成的小分子化合物包括許多化學種類，例如有機分子，包括具有大于50道爾頓 并且小于約2, 500道爾頓的分子量的小有機