用于檢測艱難梭菌的四環素耐藥基因（tet M）的LAMP試劑盒及其專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域中基因的分子生物學檢測，特別是設及一種用于檢測艱 難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)的LAMP試劑盒及其專用引物與檢測方法。
【背景技術】
[0002] 艱難梭菌（Clostridiumdifficile,Cd)是一種革蘭氏陽性厭氧芽抱桿菌，部分產 毒菌株通過分泌毒素A、毒素BW及二元毒素引起抗生素相關性腹瀉、結腸炎甚至致死性偽 膜性腸炎，統稱為艱難梭菌感染（Clostridiumdifficileinfection,CDI)。在醫院獲得感 染性腹瀉所明確的病原體中，W艱難梭菌最為常見；在抗生素相關性腹瀉病因中，艱難梭菌 亦占15% -25% ;而偽膜性腸炎則幾乎100%由艱難梭菌所致。目前，CDI的一線治療藥物 是甲硝挫和/或萬古霉素，大量研究發現：甲硝挫療效降低并出現耐藥菌株，萬古霉素敏感 性降低，導致艱難梭菌相關性腹瀉（Clostridiumdifficileassociateddisease,CDAD) 耐藥率高、復發率高、難治率高、死亡率高、醫療費用高。艱難梭菌流行株對多種抗菌藥物 均有耐藥性，而大量抗菌藥物不合理使用是導致CDI最主要的危險因素。廣州李永強等報 道艱難梭菌多重耐藥情況普遍，Ξ重及W上耐藥株占80% (李永強，憂玉強，楊銀梅.臨 床分離艱難梭菌的耐藥性分析[J].胃腸病學和肝病學雜志，2010, 19(10) :922-925);英國 Mutlu等報道艱難梭菌的某些型別菌株雙重及Ξ重耐藥率高達52. 6% -95. 4% (Mutlu，E. andA.J.Wroe,etal. (2007)."Molecularcharacterizationandantimicrobial susceptibilitypatternsofClostridiumdifficilestrainsisolatedfrom hospitalsinsouth-eastScotland."JMedMicrobiol56(Pt7):921-9.)。艱難梭菌尤 其對四環素類、林可霉素類、哇諾酬類、利福霉素類及一線藥物的耐藥性不斷增強。
[0003] 四環素是一種廣譜抗菌藥物，包括天然品金霉素、±霉素、地美環素等，W及半合 成品多西環素、米諾環素等，由于它高效、低毒、價廉而廣泛用于動物及人類臨床疾病的防 治中。四環素對細菌的耐藥機制包括：主動外排、核糖體保護、產生滅活酶及一種未明機 審IJ。經研究發現四環素耐藥基因多位于接合質粒或接合轉座子上。四環素對革蘭陰性菌 的耐藥機制W主動外排為主，主要與tetA、tetB和tetC等基因有關；而四環素對革蘭 陽性菌的耐藥機制則W核糖體保護為主，主要與tetW、tetK、tet^tetΜ和tet0等 基因有關。四環素類抗生素與艱難梭菌的核糖體結合，阻止氨基酷tRNA進入核糖體A位 而抑制細菌蛋白質合成，從而發揮抑菌、殺菌作用。艱難梭菌對四環素的主要耐藥基因為 tetM，而tetΜ為核糖體保護蛋白，存在于細胞質中，保護核糖體免受四環素類藥物的作 用，具有核糖體依賴的=憐酸鳥巧（GT巧水解酶活性，使四環素和核糖體結合能力減弱，從 而產生耐藥。大量國內外研究表明，艱難梭菌對四環素耐藥率較高。上海黃海輝等報道 110株艱難梭菌中對四環素的耐藥率為62. 7%，tetΜ基因檢出率為97. 1 %化uang，H.and A.Weintraub,etal. (2010)."Antimicrobialsusceptibilityandheteroresistance inChineseClostridiumdifficilestrains."Anaerobe16 (6):633-5.);意大利 Spigaglia等報道90株艱難梭菌中對tetΜ基因檢出率為21. 1% (Spigaglia,P.and F.Barbanti,etal. (2006)."Newvariantsofthetet(M)geneinClostridiumdiffici leclinicalisolatesharbouringTn916-likeelements."JAntimicrobChemother 57化）：1205-9.)。綜上所述，國內艱難梭菌對四環素耐藥率和tetM基因檢出率普遍較高， 故在臨床使用四環素類藥物時，應注意對患者密切觀察和監測，一旦出現腹瀉，應及時檢測 艱難梭菌及其毒素，并作出相應處理，W防出現嚴重的偽膜性腸炎。
[0004] 目前，國內最常用PCR檢測tetΜ基因，但因實驗設備要求高、操作復雜、速度慢， 擴增完成后需要對產物進行電泳、顯影等一些繁瑣步驟，不適合基層醫院及現場快速檢測 的應用。因此，尋找快速、特異、敏感檢測艱難梭菌中的四環素耐藥基因（tetΜ)有利于控 制CDI危險因素，指導臨床診療。 陽0化]隨著分子診斷技術的不斷進步，T.Notomi發明的一種新型核酸擴增技術一環介導 恒溫擴增技術（LAMP),該技術針對祀基因的6個區域設計4條特異引物，在恒溫化3-67Γ) 的條件下，利用高活性鏈置換DNA聚合酶度StDNA聚合酶），使得鏈置換DNA合成在不 停地自我循環，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物一白色的焦憐酸儀沉淀產生，從而 實現對目的基因的快速檢測（NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediated isothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000 ;28(12) :63.)。該方法檢測 時間短（30-60min)，無需特殊儀器，操作簡便，配合相應顯色試劑還能實現肉眼判別結果。 LAMP方法目前已經成功應用于臨床診斷流行細菌或病毒的定性和定量檢測、胎兒性別鑒定 等，成為常用的臨床快速檢驗方法之一。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測艱難梭菌的 四環素耐藥基因（tetM)的LAMP試劑盒及其專用引物。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了用于對艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)進行LAMP檢測的引物， W實現艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)的批量檢測，提高檢測的特異性和靈敏度。
[0007] 本發明所提供的用于檢測艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)的LAMP引物，是 根據艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)(GenBank:AB054984. 1)的特異性保守祀序列設 計的，用W定性檢測肌肉、血液、糞便等樣品中的艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)，所述 LAMP引物由五條引物組成，包括外引物tetM-F3和tetM-B3、內引物tetM-FIP和tet M-BIP化及環引物tetM-LB的組合；所述艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetΜ)的特異性保 守祀序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
[000引具體來講，所述用于對艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)進行LAMP檢測的五條 引物的核巧酸序列如序列表中沈QIDN0:2(tetM-F3)、沈QIDN0:3(tetM-B3)、沈QID N0:4(tetM-FIP)、沈QIDN0:5(tetM-BI巧和沈QIDN0:6(tetM-LB)所示。
[0009] 所述的LAMP引物，為外引物tetM-F3和tetM-B3、內引物tetM-FIP和tetM-BIP 及環引物tetM-LB按摩爾比1 :8 :3的組合物。
[0010] 本發明的第二個目的是提供一種用于對艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetΜ)進行 LAMP檢測的試劑盒。
[0011] 本發明所提供的試劑盒，包括上述用于對艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)進 行LAMP檢測的引物。
[0012] 具體來講，所述試劑盒包括W下用于23μΙ反應體系（不含模板）的試劑： MixUire 20. 9yL(主要成分包括：2mM Tris·肥1(抑8. 8)0. 7yL，10mM KC1 3. 8yL， 10mM(NH4)2S〇4 3.8yL，0.1%Tween20 0.4yL，0.8M甜菜堿化etaine)0.3yL，8mM MgS〇4 3 μ L, 1. 4mM dNTP each 0. 5 μ L，8U Bst DM polymerase 1 μ L，（1地2〇7. 4 μ L)，引物加 入量分別為：①50mM引物tet M-F3 0. 1化，使終濃度為5pmol;②50mM引物tet M-B3 0. 1 μ L，使終濃度為5pmol;③50mM引物tet M-FIP 0. 8 μ L，使終濃度為40pmol;④50mM 引物tet M-BIP 0. 8 μ L，使終濃度為40pmol⑥50mM引物tet M-LB 0. 3 μ L，使終濃度為 ISpmol。
[0013] 為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含四 環素耐藥基因（tetM)的艱難梭菌基因組DNA，所述陰性對照為不含DNA的LAMP擴增體系 (如雙蒸水、去離子水）。
[0014] 上述LAMP引物或試劑盒在艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)的LAMP檢測中的 應用也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 本發明的第Ξ個目的是提供上述LAMP引物或試劑盒在艱難梭菌的四環素耐藥基 因（tetM)的LAMP檢測中的應用。
[0016] 該應用設及艱難梭菌的四環素耐藥基因（tetM)的LAMP檢測，可包括W下步驟：
[0017] 1)W待