一種b族鏈球菌pcr熒光探針法核酸檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種B族鏈球菌核酸檢測試劑盒，具體設及一種B族鏈球菌PCR巧光 探針法核酸檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] B族鏈球菌（groupBstreptococcus,GB巧是一種寄生于人類泌尿生殖道及下消 化道的條件致病菌，健康人群帶菌率可達35%。早在20世紀70年代B族鏈球菌就已經被 證實為圍產期母嬰感染的重要致病菌之一。定植于產婦生殖道的B族鏈球菌，可在分娩時 垂直傳播給新生兒，而新生兒B族鏈球菌感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥 致死率極高，并可導致神經系統后遺癥。2010年美國疾病預防中屯、制定了《圍產期GBS預 防指南》，建議孕婦于妊娠35-37周進行GBS篩查。
[0003] 目前，B族鏈球菌的診斷方法主要有培養法和免疫學方法，其中，培養法的特異性 和敏感性高，但臨床檢測時間過長（至少需要24h-4她，甚至更長時間），過程繁瑣，需要 使用特殊的培養介質W及易受雜菌影響，不適用于大范圍檢測。免疫學方法，如：乳膠凝 集實驗（latexagglutination,LA)，酶聯免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA)，協同凝集試驗(^countercurrentimmunoelectrophotesis,CoA)及對流免疫 電泳kountercurrentimmunoelectrophotesis,CIE；)等，雖然特異性可W高達 95%，但是 敏感性不夠，檢出率較低。美國抑A已于1997年發出了運些方法假陰性和假陽性率均很高 的可行度警告，加之其試劑盒價格昂貴，所W運些方法的應用迅速減少。
[0004] 近年來，聚核酶鏈式反應（PCR)法漸漸顯現了其在檢測上的優勢，標準PCR過程分 為Ξ步：DNA變性（90°C-96°C):雙鏈DNA模板在熱作用下，氨鍵斷裂，形成單鏈DNA;退火 (60°C-65°C):系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈；延伸（70°C-75°C):在 Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，W脫氧核糖核巧Ξ憐酸（dNT巧為原料，從引物 的3'端開始W從5' - 3'端的方向延伸，最終合成與模板互補的DNA鏈。每一循環經過 變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
[0005] 運用PCR技術檢測主要設及到兩個方面：核酸的提取和核酸的擴增檢測。目前，國 內臨床上主要采用煮沸法對B族鏈球菌的核酸進行提取：先將分泌物樣本濃縮、洗涂，再加 裂解液，煮沸，高速離屯、，取上清為模板。步驟繁瑣，而且各廠家濃縮和裂解效率差異較大， 樣本依賴性強，對于較復雜的樣本提取效率低。
[0006] 巧光定量PCR技術是基于傳統PCR技術并結合光譜技術而發展起來的一種更靈 敏、更特異、更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確，重復性高，能動態反應患者治療前、后 病原體動態變化及與臨床的關系，且整個過程中避免了傳統PCR需后處理的問題，減少了 污染。實時巧光定量PCR技術使用一種帶有巧光檢測裝置的PCR擴增儀，巧光檢測裝置能夠 按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測巧光信號，通過檢測巧光信號 的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴 增曲線，根據擴增曲線與巧光闊值線的交點（即Ct值）W及擴增曲線的形狀，可W判斷陰 陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可w通過軟件自動分析 獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值（即定量檢測）。與傳統的PCR相對比，其在反 應體系中增加了一條兩端分別標記巧光報告基團和澤滅基團的探針。探針結構完整時，巧 光報告基團發出的巧光能量被澤滅基團吸收，呈現澤滅效應；如果擴增過程中有祀序列的 存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，巧光報告基團與澤滅基團相 互解離，阻斷了二者間巧光能量轉移效應，巧光報告基團發出的巧光信號被巧光檢測裝置 收集。隨著擴增的進行，巧光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后，可W 通過巧光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可W獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果， 因此，該技術在祀多核巧酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十 分廣泛的應用。研究顯示，實時巧光PCR檢測方法與標準的細菌培養方法在GBS檢測的敏 感性和特異性方面均達90%W上，達到篩檢標準，已經得到美國食品和藥品管理局（抑A) 的批準并應用于臨床。因此，在國內采用實時巧光PCR技術進行GBS篩檢是最快速、可靠的 方法。
[0007] 目前，國內已有數種基于實時巧光PCR技術檢測B族鏈球菌-DNA的試劑盒應用于 臨床檢測中，運些試劑盒所提供的B族鏈球菌-DNA提取方法主要是煮沸法。在實際臨床應 用中，此方法暴露出諸多不足之處：1)核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣 本時，經過煮沸裂解、高速離屯、富集DNA等多個步驟，DNA損耗嚴重，且對高濃度的樣本存在 裂解和富集不充分的問題；2)同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣 溶膠污染；3)檢測靈敏度偏低，約在lOOOcopies/ml左右；4)沒有設置陽性內對照（即內 標），無法監控假陰性。
【發明內容】
[0008] 本發明提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，W解決現有技術中 試劑盒檢測效果差、靈敏度低的問題。
[0009] 本發明提供一種核酸釋放劑在B族鏈球菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎 梵婷0.05-0.51111/1、氯化鐘 100-3001111/1、十二烷基橫酸鋼0.05-3%和乙醇0.01-1%。
[0010] 本發明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括：核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵 婷0. 05-0. 氯化鐘100-300mM/l、+二烷基橫酸鋼0. 05-3%和乙醇0. 01-1% ;所述 PCR反應液包括用于祀多核巧酸擴增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探 針。
[0011] 優選的，所述用于祀多核巧酸檢測的探針序列為：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCT GGCAACAAAAGT-3^ 〇
[0012] 優選的，所述用于祀多核巧酸擴增的上游引物和下游引物的序列分別為：上游引 物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ；下游引物：5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0013] 優選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括內標，所述內標序 列為：5，-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACGAAGGTC TTTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 >。
[0014] 優選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括用于內標片段擴 增的上下游引物和用于檢測內標的探針，且所述檢測內標的探針序列為：5' -ATTACTCTTGTC ACAGCGTCGTTTGCG-3'。
[001引優選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒中還包括酶混合液，所述 酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶和尿喀晚DNA糖基化酶，同時在所述PCR反應液中還包括 加TP。
[0016] 優選的，所述B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒還包括陽性對照和陰性 對照。
[0017] 本發明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括PCR反應液，所述PCR反應液包括用于祀多核巧酸擴 增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針，且所述用于祀多核巧酸擴增的 上游引物和下游引物的序列分別為：上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3';下游引物： 5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0018] 本發明還提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌 PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒包括PCR反應液，所述PCR反應液包括用于祀多核巧酸擴增 的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針，且所述用于祀多核巧酸檢測的探 針序列為：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3，。
[0019] 本發明的實施例提供的技術方案可W包括W下有益效果：
[0020] 本發明提供一種B族鏈球菌PCR巧光探針法核酸檢測試劑盒，所述B族鏈球菌PCR 巧光探針法核酸檢測試劑盒包括：核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷 0.05-0.51111/1、氯化鐘100-3001111/1、十二烷基橫酸鋼0.05-3%和乙醇0.01-1%;所述口〇? 反應液包括用于祀多核巧酸擴增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸檢測的探針。