豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基因多態性及其與繁殖性狀關聯性的測定方法，尤其設及一種豬 基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法。
【背景技術】 陽〇〇引在現在的養豬產業中，我們國家種豬育種往往會陷入一個怪圈，即"引種-退 化-再引種-再退化"，吳常信院±認為產生運種怪圈現象的原因有兩個方面，一方面是在 種豬引種的同時已落后，別的國家不會把最好的豬給我們；二是種豬引進后選育的提高效 果沒有國外好。為了走出運種怪圈現象，行業內公認的較為可行的方案是：在引種的同時， 應該運用有效地育種手段，對母豬的繁殖性狀進行改良，保持母豬群體的高繁殖率。目前， 我國常用的育種方法有兩種：傳統育種和分子育種。傳統育種方法主要是指W數量遺傳學 為理論依據的"數量遺傳學方法"。繁殖力是數量性狀，其受遺傳因素的影響較小，遺傳力估 值為0. 1~0. 2。所W，采用傳統的育種方法，對提高母豬的繁殖性能的作用很小，并且耗時 費錢。隨著分子生物學的發展，人們已經開始從分子方面來尋找提高母豬繁殖性能的育種 方法，并且取得了很好的成果。
[0003] 隨著分子生物學的快速發展，越來越多的學者開始關注如何在分子水平上來提高 母豬的繁殖性能，并且經過研究，發現了一些與繁殖性能相關的主效基因和有重要作用的 候選基因，例如：催乳素受體基因（P化時、促卵泡素β亞基基因（F甜0)、視黃醇結合蛋白 4基因（RBP4)、雌激素受體基因巧SR)、骨形成發生蛋白7基因度ΜΡ7)。可W看出，與繁殖 性能相關的基因不僅僅局限于與生殖激素相關的基因，還有一些與生長因子相關的基因， 也影響著母豬的繁殖性能。Harvey等研究發現，有些生長因子在母豬的生殖過程中參與早 期胚胎的發育和成熟，RBP4基因和BMP7基因就是與生長因子相關的基因。RBP4基因是體 內一種重要的轉運蛋白，它的主要功能是結合并轉運維生素A及其衍生物，它們都是體內 非常重要的物質，尤其是維生素A，它對于人和動物都是不可或缺的，它可W促進精子和卵 子產生、胎盤發育、胎兒生長與發育，也可提高胚胎直徑的整齊度和胚胎發育的同步性，從 而降低早期胚胎的死亡率，也可提高仔豬初生均勻度。維生素A還能夠調節血液內孕酬的 含量，從而影響母豬的繁殖性能。維生素A還具有維持視力和上皮細胞完整性、促進生長發 育、增強機體抗病能力，對母豬繁殖性能可產生有益作用。如果人或動物體內的RBP4出現 了問題，將會對人或動物機體產生嚴重的影響，首先RBP4故障會引起維生素A的儲存、轉 運、分布及代謝的異常，其次會引發各種疾病，并影響上皮、骨組織的生長、分化與繁殖、胚 胎發育。
[0004] 骨形態發生蛋白7度MP7)是轉化生長因子-MTGF-β)超家族中的一員，研究發 現，BMP7能夠促進造骨細胞的分化和誘導異位骨的的形成，還參與許多器官的發育和形成， 在許多腎、腎上腺、骨、膀脫和腦組織W及骨肉瘤細胞中都有表達，在許多腎臟疾病模型中， 能有效阻止腎小管間隙纖維化來保護腎臟的功能，此外，BMP7能夠促進生殖系統的生長和 發育，影響動物的繁殖性能。研究表明：在雌性動物的垂體、卵巢和子宮內都發現有BMP7基 因的表達。BMP7可W促進垂體內激素的形成和釋放，也可W促進卵巢和子宮的發育和成熟， 不僅如此，BMP7還可W促進卵泡的發生和成熟，促進黃體形成、類固醇的合成W及精子的發 生和成熟。
[0005] 目前，對豬RBP4和BMP7基因的研究越來越多，但大部分研究對象都集中在外來品 種豬，特別是大白豬和長白豬。相關試驗已經證明RBP4和BMP7基因與長白豬和大白豬繁 殖性能具有一定的相關性，但RBP4和BMP7基因在安徽本地豬種上的研究近乎是空白。
[0006] 本發明所述研究W安徽省兩個本地品種（曉南黑豬及霍壽黑豬）和兩個外來品種 大白豬、長白豬為試驗對象，檢測在該四個群體中RBP4和BMP7基因的遺傳變異。通過調 取、統計分析該四個豬種群體能繁母豬繁殖性狀指標數據，并進行基因型間的關聯性分析， 探討RBP4和BMP7基因多態性對不同豬群能繁母豬繁殖性狀指標的遺傳效應，且可W外來 品種豬作為對照，來探討利用運兩個基因作為分子標記改良安徽地方母豬繁殖性能的可行 性。旨在掲示RBP4和BMP7基因與豬繁殖性能的關系，為豬繁殖性狀的育種改良尋找簡潔 高效的途徑，為安徽地方豬種的保種、選育提供理論依據，并為其開展配套系的培育積累素 材。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種操作簡便、結果可靠的豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯 性的測定方法。
[0008] 一種豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法，包括如下步驟：
[0009] (1)采集成年能繁母豬耳組織樣品；
[0010] 似耳樣組織DNA提取；
[0011] (3)PCR擴增視黃醇結合蛋白即RBP4、骨形態發生蛋白即BMP7基因目的片段；
[0012] (4)目的片段單鏈構象多態性即SSCP分析； 陽01引 巧)PCR擴增產物雙向測序；
[0014] (6)群體遺傳學特性分析； 陽〇1引 （7)ii定繁殖性能；
[0016] 做采用數學模型分析所檢測到的RBP4、BMP7基因的遺傳變異與母豬繁殖性狀指 標的關聯性。
[0017] 根據目的基因單核巧酸多態性即singlenucleotidepolymo;rphism:SNP與母豬 繁殖性狀指標的關聯性分析，探討所檢測到的SNP位點對不同豬群母豬繁殖性狀指標是否 有影響，從而判定所檢測到的SNP位點能否作為母豬繁殖性狀育種的有效標記位點。
[0018] 本發明所述豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法，其中，所述步 驟（1)具體包括如下步驟：
[0019] 耳樣組織采集對象為成年能繁母豬，其中長白豬106頭、大白豬100頭、曉南黑豬 74頭及霍壽黑豬59頭。其中霍壽黑豬采自霍邱安徽浩宇牧業有限公司，曉南黑豬采自績溪 安徽豐潤生態農業開發有限公司，長白豬、大白豬采自肥東安泰農業開發有限公司。
[0020] 提前在1. 5血的化pendo計管中注入70%體積分數濃度的酒精，然后每頭母豬采 耳組織塊Ig，裝入所述化pendo計管中，于-20°C保存備用。
[0021] 本發明所述豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法，其中，所述步 驟（2)具體包括如下步驟：
[0022] 耳樣組織DNA提取過程為：①用眼科剪剪取0. 2g耳組織，去除其表面毛發及酒精， 裝入1. 5血邱pendorf管中，并盡可能將耳組織剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物 科技有限公司的組織DNA提取試劑盒提取；③將得到的DNA調終濃度至l(K)ng/μL放在 2-8攝氏度保存；④DM純度檢測：取1 μLDM在SMA1000上測定0D260/0D280的比值， 當0D260/0D280比值在1. 8-2. 0之間說明所提DNA純度較高；⑥質量檢測：將所提DNA用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察提取產物的質量W便進行后續實驗。
[0023] 本發明所述豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法，其中，所述步 驟（3)具體包括如下步驟： W24] ①W步驟似獲得的耳組織樣DNA為模板，根據GenBank豬RBP4基因外顯子1、 5、6及內含子3序列，其登錄號為NC_010456. 4,采用PrimerPremier5.0軟件設計4對引 物，進行RBP4基因部分序列的克隆，并采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆產物是否為目的 片段；其中引物RBP4exonl、5、6及內含子3的核巧酸序列如序列表中SEQIDN0:1和SEQ IDNO:2、沈QIDNO:3和沈QIDNO:4、沈QIDNO:5和沈QIDNO:6及沈QIDNO:7和 SEQIDNO:8所示，退火溫度及目的片段長度見表1 ; W25] ②W步驟似獲得的耳組織樣DNA為模板，根據GenBank豬BMP7基因外顯子2、 3、7及內含子2序列，其登錄號為NC_010459. 4,采用PrimerPremier5.0軟件設計4對引 物，進行BMP7基因部分序列的克隆，并采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆產物是否為目的 片段；其中引物BMP7exon2、3、7及內含子2的核巧酸序列如序列表中SEQIDN0:9和SEQ IDNO: 10、沈QIDNO: 11和沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14及沈QIDNO: 15 和SEQIDNO: 16所示，退火溫度及目的片段長度見表2 ;
[00%] ③按照PCR擴增體系將各種試劑和溶液混勻后放入PCR儀中，在94°C條件下預變 性5min，然后再94°C條件下變性30s，復性30s，退火溫度根據各引物的最佳退火溫度而定， 在72°C條件下延伸30s，30個循環，最后在72°C條件下延伸lOmin，在4°C條件下保存備用；
[0027] 所述PCR擴增反應體系為：2XReactionMix10μLdd&0 8. 32μLDNA Polymerase0. 2μL，Forwardprimer0. 24μL，Reverseprimer0. 24μL，DNAΙμΙ。
[0028]本發明所述豬基因多態性及其與母豬繁殖性狀關聯性的測定方法，其中，所述步 驟（4)具體包括如下步驟：
[0029] 先將步驟（3)所述各引物對的PCR擴增產物分別進行非變性聚丙締酷胺凝膠電 泳，然后分別進行硝酸銀染色后用凝膠成像系統觀察電泳結果得到所述豬RBP4、ΒΜΡ7基因 單鏈構象多態性；
[0030] 其中，所述非變性聚丙締酷胺凝膠電泳具體包括如下步驟：