一種免疫球蛋白g片段的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體設及一種免疫球蛋白G片段的制備方法及應用， 特別設及一種高純度F(油'）2抗體片段的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)是機體產生的一種特殊的蛋白質，主要存在于 生物體血液和其他體液（包括組織液和外分泌液）中。多數Ig具有抗體活性，可W特異性 識別和結合抗原，并引發一系列生物學效應。它的理化性狀穩定、生物活性明確、與抗原結 合的特異性強、便于提取或者重組表達和質量控制，并且來源容易。運些優點使免疫球蛋白 成為解決生物學和醫學等許多重大問題的重要手段。盡管免疫球蛋白在疾病的診斷和治療 等方面有著明顯的優勢，但是常規免疫球蛋白應用也具有明顯的局限性，主要體現在其抗 原性W及分子結構的大而復雜性。前者易產生治療中的排異等副作用，后者造成其組織的 穿透力差，特異性低，表達復雜且困難。
[0003]免疫球蛋白Fab'或F(ab')2片段，由于去掉了免疫球蛋白恒定區Fc，不受位于巨 隧細胞、B細胞、T細胞、中性粒細胞和巨細胞等細胞上的Fc受體的影響，不易遭到吞隧細 胞攻擊，減少非特異性免疫反應。在使用鼠源性免疫球蛋白W及馬源性免疫球蛋白用于體 內治療的時候，Fab'或F(ab' )2片段免疫原性小，使人抗鼠免疫球蛋白、人抗馬免疫球蛋白 反應最小化。F油'或F(油'）2片段分子量小，穿透性強，到達祀標部位迅速且能滲透入組 織深層處，有利于快速結合至祀抗原，進行疾病的診斷和治療。可見，抗體Fab'或F(ab')2 片段去除Fc后具有上述優點，同時還能保留對原抗原的結合能力，藥物動力學性質得到改 善，更有利于臨床應用。
[0004] 目前免疫球蛋白F油'片段常用酶解法制備獲得。CN104498576A公開了一種固 化酶切制備Fab抗體的方法，包括如下步驟：1)固化酶的制備方法：在木瓜蛋白酶溶液中加 入活化的微球，使木瓜蛋白酶與活化偶聯填料充分偶聯；2)固化酶酶切：取2H4抗體5mg， 與5ml含100μL固定化木瓜蛋白酶的邸TA-Na2消化緩沖液混合、解育，酶濃度為0. 05mg/ ml;3)酶切后Fab抗體分離純化即得Fab抗體。木瓜蛋白酶是一種半脫氨酸膚鏈內切蛋白 酶，被廣泛用于抗體片段Fab'的制備。木瓜蛋白酶主要水解IgG的部位是在較鏈區的重鏈 鏈間二硫鍵近N端側，可將Ig裂解為2個完全相同的F油'段和1個Fc段。F油'段即抗 原結合片段，相當于抗體分子的兩個臂，由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結構域組成。 一個Fab'片段為單價，可與抗原結合但不發生凝集反應或沉淀反應。Fc段為可結晶片段， 相當于IgG的C肥和C冊結構域。Fc無抗原結合活性，是IgG與效應分子或細胞相互作用 的部位。但是由于木瓜蛋白酶是一種低特異性的蛋白水解酶，因此制備獲得的F油'產物均 一'性不佳。 陽0化]CN1266907A公開了一種單克隆抗體雙段和單段的制備方法，該方法為：粗體抗 體，酶切，二次純化和凍干，制備的F(油)2、F(油）的純度可大于98%。胃蛋白酶是一種天冬 氨酸型的內切蛋白酶，被廣泛用于抗體片段F(油'）2的制備。用胃蛋白酶水解IgG可獲得 1個F(油'）2片段和一些小片段pFc' (Fc/2)。F(油'）2是由2個F油'及較鏈區組成，由于IgG分子的兩個臂仍由二硫鍵連接，因此F(油'）2片段為雙價，可同時結合兩個抗原表位。 由于F(油'）2片段保留了結合相應抗原的生物學活性，又避免了Fc段抗原性可能引起的副 作用，因而被廣泛用作生物制品，如白喉抗毒素、破傷風抗毒素經胃蛋白酶水解后精制提純 的制品，因去掉Fc段而減少超敏反應的發生。胃蛋白酶水解IgG后所產生的pFc'最終被 降解，無生物學作用。同樣，胃蛋白酶的底物特異性不是很強，即可作用于較鏈區的重鏈鏈 間二硫鍵近C端側，也可作用于較鏈區的重鏈鏈間二硫鍵近N端側，同時由于不同IgG亞類 對胃蛋白酶消化的敏感性不一樣，尤其是IgG最難消化，甚至有抗性，因此F(ab')2得率很 低。工業生產的時候需要復雜的工藝摸索和嚴格的酶切體系控制才能獲得所需的F(油'）2 片段。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法及應用，該方法獲得的 F(油'）2?及F油'片段純度可達95%W上。
[0007] 為達到此發明的目的，本發明采用W下技術方案：
[0008] 第一方面，本發明提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法，包括W下步驟：
[0009] (1)取IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G在緩沖液中混合，解育；
[0010] (2)酶切后分離純化得到免疫球蛋白GF(油'）2抗體。
[0011] 第二方面，本發明提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法，包括W下步驟：
[0012] (1)取IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G在緩沖液中混合，解育；
[0013](2)酶切后分離純化免疫球蛋白G F(油'）2片段；
[0014] (3)分離純化的免疫球蛋白G F(油'）2片段還原為F油'片段，得到免疫球蛋白G 化b'片段。 陽015] 本發明中，IdeS作用底物只有IgG類抗體，而且與胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同， IdeS切割位點專一性高，產物均一，酶切IgG后可W獲得完整的F(ab' )2片段，其中，與抗 原結合的F(ab' )2片段分子量大小約為lOOkDa。
[0016] 優選地，步驟（1)所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段， 所述片段的序列如下：
[0017]DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNG邸DLLCGA ATAG醒L冊W抑QN邸QIKRYL邸HP邸QKINFNGEQM抑VKEAIDTKN朋LDSKLFEYF邸KAFP化STKHLGV FPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGS邸PRGGI抑AVFTRGDQS化LTS畑DFKEKNLKEISDLIK邸LTEG KALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNG化KAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQ VLGLFTLSTGQDSWNQTNHHHH皿SSG。
[0018] 本發明中，所述IdeS蛋白酶可W特異性的酶切免疫球蛋白G，特異性好，酶切后獲 得單一免疫球蛋白GF(ab'）2片段。
[0019] 優選地，所述IdeS蛋白酶含有319個氨基酸。
[0020] 優選地，步驟（1)所述的IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G的質量比為1: (100-1000)， 例如可W是 1 :1〇〇、1 :1〇1、1 :1〇2、1 :105、1 :110、1 :120、1 :150、1 :180、1 :200、1 :230、1 : 250、1 :300、1 :330、1 :380、1 :400、1 :450、1 :500、1 :550、1 :600、1 :650、1 :700、1 :750、1 : 800、1 :850、1 :900、1 :950 或 1 :1000,優選為 1 : (200-800)。
[0021] 優選地，所述免疫球蛋白G來源于人和/或動物體液中提取的IgG抗體和/或通 過基因工程重組方式表達純化獲得的IgG抗體。
[0022] 優選地，所述人或者動物血液/體液中提取的IgG抗體為馬抗血清。
[0023] 優選地，所述緩沖液為Tris-HCl、生理鹽水、憐酸鹽溶液或醋酸鋼溶液中的任意一 種或至少兩種的組合。
[0024] 優選地，步驟（1)所述解育的溫度為30-40。例如可W是30°C、3rC、32°C、33°C、 34°C、35 °C、36 °C、37 °C、38 °C、39°C或 40 °C，優選為 35-39 °C，進一步優選為 37 °C。
[002引 優選地，步驟（1)所述解育的時間為10-30min，例如可W是lOmin、llmin、12min、 13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、 25min、26min、27min、28min、29min或 30min。
[00%] 優選地，步驟（2)所述分離純化包括W下步驟：加入0. 5-1. 5%的明抓吸附熱滅活 的Fc片段，經過濾、超濾除鹽、濃縮回收后，進行離子交換柱層析，調抑值至7-8,過濾除菌 后獲得高純度免疫球蛋白GF(ab' )2。
[0027] 優選地，步驟（3)所述的免疫球蛋白GF(油'）2片段還原為F油'片段包括如下步 驟：獲得高純度的F(油'）2后，在溶液中加入1-lOOmM的乙醇胺和/或半脫胺還原，只打開 較鏈區二硫鍵，超濾去除還原劑后獲得均一的免疫球蛋白GF油'片段。
[0028] 第Ξ方面，本發明提供一種組合物，所述組合物包括第一方面所述的制備方法制 備得到的免疫球蛋白GF(ab')2片段。
[0029] 本發明中，所述組合物不含有血清白蛋白、完整免疫球蛋白G分子及免疫球蛋白G 化片段。
[0030] 優選地，所述組合物在制備治療感染性疾病、免疫性疾病和癌癥的藥物制劑和/ 或藥物組合物中的應用。
[0031] 優選地，所述組合物用于免疫抗血清和/或基因工程重組單克隆和/或多克隆抗 體的制備。
[0032] 第四方面，本發明提供一種組合物，所述組合物包括第二方面所述的制