通過紅豆杉植物細胞系三線技術大規模培養生產紫杉烷的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物細胞大規模培養生產有用小分子次級代謝產物的技術領域，具體涉及采用G-M-P三線技術，通過紅豆杉細胞規模培養生產紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的方法。
【背景技術】
[0002]紫杉醇(Paclitaxel，CAS N0.: 33069-62-4，早期和商品名為Taxol)是從紅豆杉屬植物(Taxus.L)的樹皮和枝葉中分離出來的對卵巢癌和乳腺癌有特殊療效的抗腫瘤藥物。有限的紅豆杉屬植物資源使得紫杉醇成為一種比較昂貴的藥物，并影響到它在臨床上長期、廣泛的應用。多年來，人們一直在致力于尋找解決紫杉醇藥源的新途徑。
[0003]紫杉醇化學全合成雖然早已成功，但合成路線長，產率低，成本高，不能商業化生產。半合成是目前臨床應用紫杉醇的主要來源，半合成的前體為由紅豆杉枝葉中分離得到的 Baccatin III (巴卡亭 III，本專利中簡寫為 BAT III，CAS N0.: 27548-93-2)或10-Deacetylbaccatin III(10 一去乙醜基巴卡亭 III，本專利中簡寫為 10DAB，CAS N0.:32981-86-5，極少用92999_93_4)等，但依然遠遠滿足不了臨床及實驗的需要。紅豆杉屬植物的組織與細胞培養，生產紫杉醇，以及生產重要中間體10DAB，BAT III等被認為是一種有潛力的方法之一而受到人們的重視。
[0004]在努力拓展紫杉醇的藥源并提高紫杉醇產量的同時，科學家亦投身到紫杉烷類化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷類化合物或者找到合適的先導化合物。已經有幾百種紫杉烷從紫杉原植物或細胞培養液中分離出來。其中云南紫杉烷Tc(Taxuyunnanine C，不是Taxol C)是一種具有類神經生長因子(NGF)活性的化合物，能夠強化NGF的作用，有利于老年癡呆癥(Alzheimer’s disease)的治療。Tc與紫杉醇同屬于三環二萜類化合物。
[0005]紅豆杉植物細胞培養生產紫杉醇及其中間體的工藝體系中，見圖1，目前普遍使用兩線(細胞生長G-次級代謝產物生產P兩階段)培養技術體系，見圖2。在此體系下，高產下的穩產非常困難。主要原因在于次級代謝與初級代謝非常不同，次級代謝產物不是植物細胞生長所必須的，所以要經過誘導、刺激，感受環境的壓力后，才能產生，而且其產生和產量都受到多級的調控，包括短期的正反饋和長期的負反饋，生產具有極大的不確定性。尤其是植物細胞的長期繼代中，由于對環境的不斷適應，基因組雖然變化不大，但表觀遺傳越來越不利于次級代謝的生產。對于工業化，植物細胞的繼代生長和次級代謝產物的調控生產有不同的工藝要求，比如，繼代生長要求細胞的生物量越大越好，與初級代謝無關的基因最好都是關閉的、沉沒的，染色體區域被異染色質化，涉及組蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化，DNA的甲基化修飾，甲基化修飾組蛋白結合蛋白Sir2/3/4，甲基化DNA結合蛋白，非編碼RNA等等在內的一系列復雜組分的生理反應過程。基因沉寂導致相應區段內的遺傳信息不能被轉錄。而次級代謝產物的調控生產，卻要求在主動刺激植物細胞后，植物細胞的次級代謝基因組能迅速開放，而初級代謝的基因組最好得到抑制，但又不能引起細胞的過度的凋亡和死亡。大部分的次級代謝產物，對于植物宿主細胞來說，是加重了代謝流的負擔，而且許多次級代謝產物對于宿主細胞本身也有毒性。比如，紫杉醇，就是通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂。這對同屬于真核生物的紅豆杉植物細胞來說也是具有毒性的，抑制紅豆杉植物細胞的分裂，引起細胞凋亡。因此，植物細胞的兩個階段的代謝流控制是非常對立的，轉化階段控制不好，很容易產生兩個效果:一是調控誘導無效，植物細胞繼續大量擴增，次級代謝產物極低從而沒有商業生產價值，收獲的是外觀極佳的細胞團；二是調控過頭，植物細胞大量變紅、褐化、死亡，次級代謝剛開始，細胞就死亡了，收獲的是沒有高產量的紅褐色的培養液。因此，兩線技術非常難以滿足有用次生代謝產物的生產。
【發明內容】
[0006]為克服現有技術存在的缺點與不足，本發明公開了一種采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養生產紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步驟進行:
(1)構建南方紅豆杉細胞系的繼代線，簡稱為G線，接種的細胞鮮重為100g/L，接種100%新鮮膜過濾的B5培養基，繼代生長周期為14天，在500mL搖瓶階段，新鮮B5的裝液量為20% ;在反應器中全培養液的裝液量為10~20% 個周期中細胞鮮重的倍增為2~4倍，在搖瓶培養轉速為100~120rpm，或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養；所述的B5基礎培養基指的是:生長素為2，4-D，含量10mg/L，分裂素為6-BA，含量為lmg/L，蔗糖濃度為15g/L ；
(2)構建紅豆杉細胞系的一條過渡線，簡稱Μ線，其方法是，Μ線第1代種子來源于G線，其后代的種子都是來源于上一代的Μ線，一直持續到2~7代，接種的新鮮基礎培養基為Β5，但只加50%的磷酸鹽，即使用濃度0.85g/L ;另外還添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，調整蔗糖濃度為25g/L，并進行磷酸鹽饑餓法進行細胞周期同步化培養，每代Ml線的細胞進行固定調控策略，甲基茉莉酸100 μ M、硫代硫酸銀10mM的跟蹤，其磷酸鹽饑餓法的步驟:在每代次的第7天、第10天和點12天分別加入20%、20%和10%的磷酸鹽，在搖瓶培養轉速為100~120rpm,或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養；所述的植物激素指的是，最終使用濃度的生長素為NAA 40mg/L，分裂素6_BA 2mg/L ;
(3)構建紅豆杉細胞系的一條生產線，簡稱P線，其方法是，Μ線的紅豆杉植物細胞團作為Ρ線的種子，每個Μ代次的反應器都對應一個Ρ線上的一個反應器，Ρ線上的反應器都是使用MS基礎培養基，調整植物激素配比和含量，最終使用濃度，生長素為NAA 10~30mg/L,分裂素為6-BA l~10mg/L ;調整蔗糖濃度為25~60 g/L，接種時，MS基礎培養基占50%的體積，原Μ線上培養14天的條件培養基及培養物占50%體積。接種的生物量為160~300g/L，在搖瓶培養轉速為100~120rpm，或在反應器上振蕩頻率為12~16rpm，避光培養；在培養第0-10天加入茉莉酸甲酯50-300 μ M，在第5~30天加入XAD-7性大孔樹脂5_200g/L，在第7、11、15和21天進行補料培養，所補料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基礎培養基的大量元素和茉莉酸甲酯l~100mM組成，從第10天開始補料，一直補料到第30天，補料的速率是每天補加培養起始體積的0.5%。第30天可以收獲，進行紫杉烷的分離和純化。
[0007]本發明所用的種子系為高產紫杉醇的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10002，高產10DAB的南方紅豆杉細胞系CGMCC n0.10001，高產云南紫杉烷Tc的南方紅豆杉細胞系TA-2。
[0008]本發明進一步公開了采用三線技術通過紅豆杉植物細胞培養生產紫杉烷方法在制備提高生產紫杉醇批次穩定性方面的應用。所使用的容器，包括一般性的搖瓶，也包括特指的反應器，尤其特指中國專利的一次性反應器(ZL 201210021722.6)。提高生產紫杉醇批次穩定性指的是:紫杉醇高產在100mg/L以上批次，穩定性上升到74% ;10DAB高產超過200mg/L以上批次超過70% ;云南紫杉烷lg/L以上的批次超過90% (成功批次/總批次)。
[0009]本專利通過紅豆杉植物細胞系規模培養兩線體系G-Ρ (常稱之為兩階段培養)中，插入中間階段的細胞線M，進行有序、平穩過渡，能兼顧細胞繼代生長和次級代謝產物的調控生產兩個階段的不同工藝要求。本發明與現有方案所不同的關鍵點在于: