植物細胞程序性死亡的調控因子花生類caspase-3基因及編碼序列的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程技術領域，具體設及一種植物細胞程序性死亡的調控因 子花生類caspase- 3基因及編碼序列。
【背景技術】
[0002] 侶是酸性±壤上作物生長的主要限制因子。連續施用含氨和氨化物的肥料、工業 污染、酸雨和豆科植物的固氮作用，加劇了侶毒害。目前，世界耕地的40 -70%為酸性±壤， 在我國約21 %面積的±地屬酸性±壤，分布遍及南方15個省區，總面積達2030萬公頃。在 環境污染日益嚴重，酸性±壤面積不斷擴大的今天，侶毒害已成為世界性難題，加強植物耐 侶機制研究有著重要的現實意義。
[0003] 植物細胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD)是一種受基因控制、主動有 序的細胞死亡過程，它普遍存在于植物發育及環境互作中，不僅是植物正常生長發育必需 的，也是植物一種重要防衛反應，在適應逆境中有重要作用。有研究表明，逆境可W誘導植 物PCD，如滲透脅迫、鹽、熱激、低溫、缺氧、金屬離子等。雖然植物PCD產生的信號因子還不 清楚，但越來越多的證據表明，R0S、NO、Ca2\乙締等都是環境脅迫誘導植物PCD的重要信號 分子。
[0004] 我們通過顯微、超微、巧光、DNA梯、TU肥L檢測等技術手段也證實侶能夠誘導花 生根尖細胞PCD，且發現PCD發生與花生耐侶能力負相關狂banJ，化比2013.Aluminum-inducedprogrammedcelldeathpromotedbyAhSAG,asenescence-associatedgene inArachishypoganeaL.PlantSci210:108-117)。用巧光技術研究植物侶毒害，結果 表明侶通過與線粒體呼吸鏈復合體I和III的化-S蛋白作用產生活性氧，導致線粒體腫 脹和膜滲透性轉換孔開放，隨后釋放的細胞色素C激活caspase- 3 -like蛋白酶誘導PCD 的發生。可見，侶誘導PCD是客觀存在的，但研究多停留在尋找充足的PCD證據層面，對侶 誘導PCD的分子機制和調控等缺乏深入研究。
[0005] 半脫氨酸蛋白酶（caspase)是動物細胞調亡啟動和執行階段的關鍵調節因子。在 細胞質中，通過Bax/Bcl-2表達控制細胞色素ckytoc虹omeC,切tC)、線粒體膜間隙 蛋白一核酸內切酶G巧ndoG)、細胞調亡誘導因子（AIF)、Smac/Di油1〇和Omi/化rA2的釋 放，提高線粒體膜通透性，由caspase酶類通過水解天冬氨酸殘基C末端膚鍵，激活下游 caspase蛋白酶，促使具有caspase活性的調亡小體形成，分解細胞內相關底物蛋白，導致 細胞結構和代謝發生變化，最后引起細胞調亡巧eapeTJ，McC油ePF. 2008.Apoptotic-likeprogrammedcelldeathinplants.NewPhytol180:13 - 26)。
[0006]Caspase是動物細胞調亡調控的關鍵因子，不少學者將動物細胞調亡的相關 機制引入植物研究中。然而在已公布的植物基因組序列中，沒有發現編碼caspase的基 因度onneauL，GeY. 2008.怖athappenedtoplantcaspases?JExpBot59(3): 491 -499)，但在植物皿和其他脅迫誘導PCD過程中已檢測到與caspase類似的酶活性，說 明植物PCD中存在具有類似caspase酶活性的其他蛋白酶。因此，植物caspase活性被稱為 類caspase活性（caspase-Ukeactivities)。目前通常利用哺乳動物caspase家族成員所 設及的裂解位點為參考，人工合成的四膚作為底物，檢測植物類caspase活性。根據底物的 特點，發現在植物中主要存在YVADase(VPEs)、DEVDase(metacaspase)、lETDase(caspase)、 LEHDase、LEVDase、TATDase、VEIDase、VKMDase(caspase)等類caspase活性，植物種類主 要有煙草（Nicotianabenthamiana)(KimΜ,LimJH. 2006.Mitochondria-associated hexokinasesplayaroleinthecontrolofprogrammedcelldeathinNicotiana benthamiana.PlantCell18 :2341 - 2355)、磐粟（Papaver)(BoschM,Rranklin-TongV E. 2007.Temporalandspatialactivationofcaspase-likeenzymesinduced byself-incompatibilityinPapaverpollen.ProcNatlAcadSciUSA104: 18327 - 18332)、大麥化ordeumbrevisubulatum)(BorenM,HoglundAS. 2006. DevelopmentregulationofVEIDasecaspase-likeproteolyticactivityinbarley caryopsis.JExpBot57(14) :3747 -3753)、擬南芥（Arabidopsisthaliana)(Kuroyanagi M,YamadaK. 2005.Vacuolarprocessingenzymeisessentialformycotoxin-induced celldeathinAr油idopsisthaliana.JBiolQiem280 :32914 - 32920)、燕麥（Avena s曰tiv曰）（CoffeenWC,WolpertTJ. 2004.Purificationandcharacterizationof serineproteasesthatexhibitcaspase-likeactivityandareassociatedwith programmedcelldeathinAvenasativa.PlantCell16 :857 - 873)、挪威云杉（Picea abies)(BozhkovPV,FilonovaLH. 2004.VEIDaseisaprincipalcaspase-like 曰ctivityinvolvedinpi曰ntprogrammedcellde曰th曰ndessenti曰1forembryonic patternformation.CellDeathDiffer11 :175 - 182)等，材料來源主要為葉肉組織、懸 浮細胞、幼苗、葉子、花粉等。但在花生中類caspase至今尚無相關報告。
[0007] 利用動物caspase活性抑制劑是分析植物是否存在與caspase功能相似的蛋白酶 的常用方法。桿狀病毒蛋白p35作為caspase抑制劑可W抑制多種因素誘導產生的植物 PCD,如鏈革胞菌（Alternariaalternataf.sp.Lycopersici)毒素誘導的PCD、下香假單胞 菌致病變種（Pseudomonassyringaepv.Phaseolicola)和煙草花葉病毒燈obaccomosaic virus,TMV)侵染煙草細胞形成的HR。目前應用的抑制劑主要有BocD-fmk、Ac-DEVD-C冊、 Ac-DEVD-cmk、z-DEVD-fmk、Ac-LE皿-CHO、z-VAD-fmk、z-VEID-fmk、Ac-YVAD-C冊、Ac-YVAD-cmk、z-YVAD-fmk等，均能夠抑制相關PCD的發生，如Ac-DEVD-C冊抑 制磐粟自交不親和誘導產生的PCD,紫外線誘導擬南芥葉肉細胞原生質體產生的PCD,磐粟 花粉自交不親和誘導產生的PCD;Ac-DEVD-cmk抑制白云杉種子的雌配子體細胞PCD;z-VAD-fmk抑制熱擊誘導番茄果實產生的PCD;Ac-YVAD-C冊抑制葉片組織再生引起的PCD 中酶的活性；Z-YVAD-fmk抑制熱擊誘導番茄果皮發生的PCD等。
[0008] 值得注意的是，運些抑制劑并非對所有PCD都具有抑制作用，如4[6切1^3口-Glu-Val-Asp-aldehyde(Ac-DEVD-CH0)對TMV誘導的煙草皿沒有抑制作用 Tyr-Val-Ala-Asp-aldehyde(Ac-YVAD-C冊）則可W抑制；Ac-YVAD-CH0 不能抑制磐 粟屬花粉管細胞的細胞死亡，但是Ac-DEVD-C冊卻具有運樣的功能。
[0009]Caspase是細胞調亡中起關鍵作用的一類半脫氨酸蛋白酶，在天冬氨酸位點與底 物反應。caspase作為動物PCD的功能性成分，可改變或激活某些維持細胞完整性的蛋白， caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的啟動細胞程序性死亡的執行階段。植物中雖然 沒有分離出caspase基因，但在正在死亡的植物細胞中用人工合成的caspase底物可W檢 測到caspase活性的升高。由于植物細胞程序性死亡形式存在多樣性，W及與動物細胞調 亡存在明顯差異，在近期的植物研究中，植物CLPs與動物caspase的關系越來越受到重視。 但目前暫無類caspase參與侶誘導PCD的報告。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的：為了調控植物細胞對環境變化的適應力W及維持細胞內環境穩定 和合成能力，尋找在逆境環境下花生發生細胞程序性死亡中活性最強的類caspase酶活， 提供一種植物細胞程序性死亡的調控因子花生類caspase- 3基因及編碼序列。
[0011] 本發明是運樣實現的：
[0012] 一種植物細胞程序性死亡的調控因子花生類caspase-3基因及編碼序列，尋找在 逆境環境下花生發生細胞程序性死亡中活性最強的類caspase酶為caspase- 3,并獲得調 控細胞程序性死亡的花生類caspase-3基因Ahcas-3及編碼序列；從花生根尖提取RNA得 到Ahcas-3,其0RF的堿基序列為1068bp，其堿基序列如SEQIDNO. 1所示。SEQIDNO. 1 為：
[0013]
[0014]
[0015] 所述的從花生根尖提取RNA得到Ahcas-3的cDNA序列編碼355aa，其氨基酸序列 如沈QIDNO. 2所示。沈QIDNO. 2為：
[0016]
[0017] 本發明試驗中的花生耐侶品種99 -1507和侶敏感品種中花2號，是根據發明人在 2008年3月在《中國油料作物學報》發表的《侶對花生根尖細胞形態結構的影響》中的試驗 方案獲得。
[0018] 本發明的有益效果：
[0019] 本發明的在調控細胞程序性死亡中活性最強的類caspase-3的基因Ahcas-3,提 供一種有助于調控植物細胞對環境變化的適應力W及維持細胞內環境穩定和合成能力的 方法，為植物增產增收創造條件。
【附圖說明】
[0020] 圖1:為99 - 1507花生根尖在不同侶處理下各種類caspase的活性；a- 1分別代 表顯著性差異P<〇. 05。
[0021] 圖2:為中花2號根尖在不同侶處理下各種類caspase的活性；a-1分別代表顯著 性差異P<0. 05。
[002引圖3 :為加入caspase- 3專屬抑制劑后99 - 1507和中花2號在不同處理下的類caspase- 3的活性；A-C分別代表顯著性差異P<0. 01;a-C分別代表顯著性差異P<0. 05。 [002引圖4 :為加入caspase- 3專屬抑制劑后99 - 1507和中花2號在根長生長變化量。
[0024]圖5:為加入c