具有抗逆功能的枸杞9-順式環氧類胡蘿卜素雙氧合酶基因及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及具有抗逆功能的一種構杞（Z_rc如曲cAineftseMiller)細胞膜中9-順 式環氧類胡蘿l·素雙氧合酶基因（化ne-cis-巧oxy-carotenoiddioxygenaseenzyme)的 克隆，具體為能提高植物抗逆等功能構杞類胡蘿l·素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基 因（ACfW)及應用。
【背景技術】
[0002] 植物類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶(ΛΟ?執能催化裂解9-順式新 黃質巧-cis-neoxanthin)和 9-順式紫黃質（9-cis-violaxanthin)的 11, 12 和 11', 12'雙鍵，生成脫落酸（ΑΒΑ)的前體物質C15黃質醒（xanthoxin)，黃質醒進一步轉化為脫 落酸巧ndoetal.，2008)，而脫落酸是重要的植物激素。
[0003]ΛΚ恐嚴初是在玉米viviparous14 (vpl4)突變體中發現的，該突變體內源ΑΒΑ 含量很低，氣孔不能正常關閉，植株萎黨，呈現ΑΒΑ合成缺陷型（Schwartzetal., 1997)， 由于突變基因產物化14是一個雙氧合酶，可催化裂解兩個9-順式環氧化類胡蘿h素，故名 yVfiS?。yVfiS懼化9-順式紫黃質和9-順式新黃質裂解形成C15的黃質醒（xanthoxin)和一 個C25的副產物（Schwartz, 1997)。裂解反應后，黃質醒從質體中轉運到細胞質中，在細胞 質酶的作用下轉化為ΑΒΑ，在無細胞提取物中，黃質醒轉化為ΑΒΑ需要輔助因子NAD和NADP 的參與。
[0004] 非生物脅迫如干旱等均可W促進嫌]mRNA和相應的NCED蛋白的表達水平， 同時ΑΒΑ的含量也迅速增加，證明艦??在ΑΒΑ生物合成與環境響應中起重要作用。Luchi etal. (2001)報道在擬南芥葉片中，巧是主要的脅迫誘導基因。而在班豆葉片中， 干旱脅迫能夠強烈誘導化NCED1基因的表達，盡管化基因的誘導表達稍早于ΑΒΑ的 積累。干旱脅迫也能誘導玉米、菜豆和番茄ΛΚ2Ζ湛因的表達（Burbidgeetal., 1997; QinandZeevaart, 1999;Schwartzetal., 1997)。任慧波等（2008)報道，^(7\打公化觀 持續誘導是ΑΒΑ穩定積累的前提，干旱可誘導八yVfiS口基因表達，八ΛΚ思口處于誘導表達狀 態與ΑΒΑ的持續積累相伴隨，進一步證明yVfiS在ΑΒΑ生物合成與環境響應中起重要作用。 在離體葉片或干旱處理15-30min后能發現ΛΚ2Ζ轉錄水平顯著增高（QinandZeevaart, 1999;Thompsonetal.，2000)，表明yVfiS?因起作用是相當迅速的。在滲透脅迫下，使 用NC邸酶競爭性抑制劑AbamineSG，能夠明顯抑制魏豆（化?歴況?。>歴)和擬南芥中ΑΒΑ 的生物合成，明顯減少植物體內ΑΒΑ含量化it址ataetal.，2006)，也表明艦$化?在ΑΒΑ 生物合成中具有關鍵作用。目前艦恐^因已在多個植物被克隆，例如番茄（Burbidgeet al.,1997)、菜豆（QinandZeevaart1999)、班豆（luchietal., 2000)、鱷梨（Qiernys andZeevaart, 2000)、擬南芥（luchietal., 2001;Tanetal., 2003)等。
[0005]Λ?進/?因包含一個小的基因家族，在擬南芥中已發現5個Λ?進/?因，全都定位在 質體膜中。高等植物ΛΟ雙催化的反應是ΑΒΑ的生物合成中關鍵步驟，過量表達都 導致轉基因植物內源ΑΒΑ含量的增加。在±豆中，湛因的過表達和±豆分生組織及 上豆皮中的aba含量具有相關性（（Destefano-Bel化?ηetal., 2006))。在煙草中表達菜 豆基因，煙草中ΑΒΑ含量被提高了 3. 5倍，同時提高了植物的抗旱性（xiaoqiong qinetal.，2002)。在番茄和煙草中表達番茄的NCED基因，也能過量產生ΑΒΑ,也表明活體 植物上yVGS?因表達和ΑΒΑ產生中具有高度一致性。在甸筒剪股穎中過表達班豆化Λ?進W 基因，內源ΑΒΑ顯著增加了，轉基因植物明顯增加了在干旱和化化脅迫下的生存能力。
[0006]ΑΒΑ生物合成一般經過兩條途徑兩日直接途徑和C4。間接途徑狂eeva-art， 1999)。Cl日途徑，即Ξ個異戊締單位聚合而成15順式法尼基焦憐酸（Farnesyul pyro地os地ate,FPP)，再由FPP經環化和氧化直接合成的順式ΑΒΑ,運種途徑主要發生 在一些真菌中（化eelmanandZeevaart, 1984);〔4。途徑是高等植物ΑΒΑ合成的主要途徑， 即先由甲徑戊酸（Mevalonicacid，MVA)聚合成Cw前體--類胡蘿h素，再由類胡蘿l·素 裂解成C15的化合物黃質醒狂anthoxin,XAN)，最后由XAN轉變成ΑΒΑ。
[0007]ΑΒΑ是一種植物激素，它在調節植物的生長、發育、種子的休眠W及植物對逆境脅 迫的適應中起著重要的作用。而利用因能提高多種植物的抗逆性，已在多種文獻中 有所報道，目前已有多種植物的艦1思^因已克隆。由于因能改良植物生長發育及 抵抗非生物脅迫等重要作用，因此已成為當今植物改良研究中的一個熱點。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基 因。
[0009] 本發明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。
[0010] 本發明的目的還在于提供含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0011] 本發明的另一個目的在于提供該基因的用途。
[0012] 本發明提供了一種構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因 如序列表中SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列構成。
[0013] 本發明提供了一種上述構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因 Z皿編碼的蛋白質，如序列表中SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列的蛋白質。
[0014] 本發明提供了一種上述構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心7 艦恐?7重組克隆載體PMD18-T-心?艦恐?人
[0015] 本發明提供了一種上述構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心7 重組植物表達載體PCAMBIA2300-心？
[0016] 含有上述的構杞類胡蘿l·素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心的重 組載體，運些重組載體包括質粒。
[0017] 所述的質粒表達載體大腸桿菌表達載體pGEX-4T-l-Z?VfiS?A
[0018] 所述的質粒表達載體雙元植物表達載體PCAMBIA2300-
[0019] 含有上述構杞類胡蘿l·素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心完整編 碼閱讀框序列的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 所述的宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或煙草細胞。
[0021] 本發明提供了 一種含有心? 基因工程菌。
[0022] 上述構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心的應用，包括 該心？ 基因編碼的蛋白在大腸桿菌和植物中的應用；用所述的重組載體，如植物表達 載體轉化玉米細胞；或者用所述含有該基因的農桿菌與玉米、大豆、向日葵、馬鈴馨、棉花、 谷子、大麥W及花弁和蔬菜等細胞共培養，得到轉基因的再生植株；或者用所述的LmNCEDl 遺傳轉化獲得上述物種轉基因植株。
[0023] 本發明提供的一種構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心7 yVGS?厶如序列表中SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列，還包括所示的核巧酸序列添加、取代、 插入或缺失一個或多個核巧酸的70%W上同源序列或者其等位基因及其衍生的核巧酸序 列。
[0024] 本發明提供的一種構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因 編碼的蛋白，如序列表SEQIDNO. 2所示氨基酸序列。
[00巧]本發明的克隆方法由下述步驟組成： 從構杞葉片中提取總RNA，根據NCBI中已登錄的番茄（Z97215)、馬鈴馨（AJ276244)、 煙草（JX101472)的保守核巧酸序列，分別從5'端和中間保守區域設計上游簡并引物 yV您W-JF:5'-ATGGCMACTACTTCTTCTCCTGCTAC-3' 和中間特異性上游引物NCED1-BF: 5'-ATCCTGTTTCAGGGGAGCTT-3'。中間特異上游引物艦SW-BF與3'RACE試劑盒中下游 Outer引物利用RACE技術擴增得到其3'端末端全長序列；同時根據已獲得的3'端序列設 計下游特異性引物，通過PCR擴增獲得心基因的全長序列。
[0026] 本發明構建含構杞類胡蘿h素9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心？ 思 的大腸桿菌表達載體pGEX-4T-l-Z?VfiSA由下述步驟組成： 化;構建含有構杞9-順式-環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因心的中間載體PMD-18T-Z皿VC展 設計由沈QIDNO. 3 所示的上游引物P1 (P1 :5' -ATGGCAACTACTTCTTCTCCTGC-3')，和 由沈QIDNO. 4 所示的下游引物P2 (P2 :5' -TTAGGCCTGATTTGCCAAGTC-3'），W構杞 9-順 式環氧類胡蘿l·素雙氧合酶基因心WC娜7的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物 連接于PMD18-T載體，獲得含有序列表中SEQIDNO. 1所示的心?艦恐?7基因的中間載體 pMD18-T-ZMm?7〇
[0027] 鐵構建大腸桿菌表達載體PGEX-4T-1-心 設計由沈QIDNO. 5 所示的上游引物P3(P3:5'-CGCGGATCCATGGCAACTACTTCTTCTCCTG C-3，），和由沈QIDNO.6所示的下游引物P4(P4:5，-CCGCTCGAGTTAGGCCTGATTTGCCAAGTC -3'），W質粒pMD18-T-L?VfiS巧％模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物經化細創和描口刀 酶切后，將大腸桿菌表達載體PGEX-4T-1經化細創和描〇刀雙酶切，二者進行連接反應，得 到大腸桿菌表達載體pGEX-4T-l-Z?VfiS?y。
[0028] 本發明提供了一種構杞9-順式環氧類胡蘿h素雙氧合酶基因的重組載體和宿主 細胞及應用，首次從構杞中分離出編碼