幽門螺桿菌抗生素耐藥性分析試劑盒及耐藥性檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于檢測分析幽口螺桿菌抗生素耐藥性的試劑盒W及耐藥性檢 測方法,尤其設及一種基于多重基因分析系統的幽口螺桿菌抗生素耐藥性分析試劑盒及檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 幽口螺桿菌化elicobacterPylo;ri,H.wlori)生存于人體胃部,是最常見的細菌 病原體之一,世界有多半人口受到過幽口螺桿菌的感染。幽口螺桿菌感染可能引起慢性胃 炎、消化性潰瘍,嚴重者則發展為胃癌、胃黏膜相關性淋己組織淋己瘤。
[0003] 隨著抗生素的廣泛使用,幽口螺桿菌耐藥菌株也在日益增多,幽口螺桿菌對抗生 素產生耐藥已經成為其根除率下降的最主要原因,運不但給臨床治療帶來困難,也增加了 患者的經濟負擔,導致醫療資源極大浪費。
[0004] 耐藥性檢測是實施個體化治療的前提,可W避免重復使用已經產生耐藥性的抗生 素、并根據藥敏實驗選擇有效抗生素。
[0005] 目前,已有多種檢測幽口螺桿菌抗生素耐藥性的方法,傳統方法檢測幽口螺桿菌 抗生素耐藥性主要局限于藥敏試驗,但E-test耗材昂貴,紙片擴散法缺乏有效的判斷標 準,瓊脂稀釋法對操作技術要求較高;而且藥敏試驗不能鑒定H.pylori菌株基因突變的位 點。另外,幽口螺桿菌對培養要求苛刻,微需氧條件下生長緩慢,不適合臨床常規開展。如: ①分離培養鑒定:幽口螺桿菌培養成菌落后,經生化反應鑒定。由于幽口螺桿菌培養需要 微需氧條件,對營養條件要求苛刻,所W極易造成假陰性,其靈敏度僅有40%-70 %,檢出 率低。且幽口螺桿菌培養需要一定時間,不利于快速診斷。②UBT:根據標志物不同可分為 "C-UBT和"C-UBT,臨床應用廣泛,技術要求低。缺點是費用高,易受抑酸劑和抑菌藥物影 響,敏感度低。③免疫學檢查:檢測糞便中幽口螺桿菌的抗原或血清中幽口螺桿菌抗體。優 點是快速、無損傷,缺點是不能判斷現癥感染還是既往感染。④組織病理切片染色法:該法 是把患者胃鏡檢查活檢組織切片,染色后觀察組織中的幽口螺桿菌。優點是可同時進行胃 黏膜的病理學診斷,且特異性和敏感性均較高。但該方法受幽口螺桿菌載量影響明顯,且操 作繁瑣、費時,不適于大通量樣本的檢測。
[0006] 隨著分子生物學技術的發展,PCR、巧光原位雜交、基因忍片、DNA測序等技術已被 用于幽口螺桿菌抗生素耐藥性的檢測,包括:普通PCR、寡核巧酸探針雜交、基因忍片、測序 等。但W上檢查方法均存在檢測位點少、特異性低,通量小等缺點,且不能同步進行耐藥性 分析。
[0007] 目前檢測幽口螺桿菌抗生素耐藥的分子生物學技術還存在費用高、臨床難普及等 缺點,因此,亟需開發一種快速、準確、便捷、經濟的多重基因檢測的方法,同步完成幽口螺 桿菌鑒定、多位點耐藥性分析,從而探索一種新的基于耐藥性分析的幽口螺桿菌檢測及個 體化幽口螺桿菌根除模式,更好地指導臨床合理應用抗生素,降低耐藥菌株的出現,減少患 者經濟負擔。
【發明內容】
[000引針對目前幽口螺桿菌對抗生素耐藥性檢測方法存在的問題,本發明提供了一種基 于多基因的幽口螺桿菌抗生素耐藥性分析試劑盒及耐藥性檢測方法。
[0009] 本發明第一個方面是提供一種幽口螺桿菌抗生素耐藥性分析試劑盒,包括引物, 所述引物包括針對幽口螺桿菌抗生素耐藥相關基因W及鑒定基因16SrRNA設計的引物。
[0010] 其中,所述幽口螺桿菌抗生素耐藥相關基因選自:23SrRNA、gyrA、porD中的一種 或幾種。
[0011] 在本發明的一種優選實施例中,所述引物包括針對幽口螺桿菌16SrRNA基因、W 及抗生素耐藥相關基因23SrRNA、gyrA、porD設計的引物。
[001引在本發明的一種優選實施例中,在正向引物5'端連接正向通用Tag序列,反向引 物5'端連接反向通用Tag序列。
[001引其中,所述正向通用Tag序列為:5' -AGGTGACACTATAGAATA-3'。
[0014]其中,所述反向通用Tag序列為:5' -GTACGACTCACTATAGGGA-3'。
[0015] 在本發明的一種優選實施例中,針對每一抗生素耐藥相關基因設計的引物包括至 少兩條反向引物。
[0016] 其中,兩條反向引物分別針對野生型基因和突變型基因設計。
[0017] 其中,所述突變優選為:
[001引23SrRNA基因2143位點堿基A發生突變,如突變后堿基為G;
[0019]porD基因347位點堿基C發生突變,如突變后為T、G、A中的任意一種;
[0020] gyrA基因261位點堿基C/T發生突變,如突變后為G/A。
[00引]其中,更優選地,針對23SrRNA基因設計的引物序列為:
[0022]沈QIDNo. 1 :5' -AACCGCGGCAAGACGGCA-3,;
[0023]沈QIDNo. 2 :5, -GATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3,;
[0024]沈QIDNo. 3 :5' -GGTATCTCAAGGATGGCTCC-3,。
[0025] 其中,更優選地,針對23SrRNA基因設計的引物序列連接Tag序列后為:
[0026] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAAACCGCGGCAAGACGGCA-3,;
[0027] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAGATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3,;
[0028] 5, -AGGTGACACTATAGAATAGGTATCTCAAGGATGGCTCC-3,。
[0029] 其中,更優選地,針對gyrA基因設計的引物序列為:
[0030]沈QIDNo. 4 :5' -AGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3,;
[0031]SEQIDNo. 5 :5, -CTAGCGCATCATAAACCGTY-3,;
[0032]沈QIDNo. 6 :5, -TAGAAGTGGGGATTGATTCT-3,。
[0033] 其中,更優選地,針對gyrA基因設計的引物序列連接Tag序列后為:
[0034] 5' -GTACGACTCACTATAGGGAAGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3,;
[0035] 5' -GTACGACTCACTATAGGGACTAGCGCATCATAAACCGTY-3,;
[0036] 5' -AGGTGACACTATAGAATATAGAAGTGGGGATTGATTCT-3,。
[0037] 其中,更優選地,針對porD基因設計的引物序列為:
[0038]沈QIDNo. 7:5, -GAACAAATTGAGCCTGCYGC-3' ;
[0039]沈QIDNo. 8:5' -ACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3';
[0040]沈QIDNo. 9 :5' -GCGTTGATGGGGTGATAGCA-3,。
[0041] 其中,更優選地,針對porD基因設計的引物序列連接Tag序列后為:
[0042] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAGAACAAATTGAGCCTGCYGC-3,;
[0043] 5, -GTACGACTCACTATAGGGAACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3,;
[0044] 5, -AGGTGACACTATAGAATAGCGTTGATGGGGTGATAGCA-3,。
[0045] 其中,更優選地,針對16SrRNA基因設計的引物序列為:
[0046]沈QIDNo. 10 :5, -CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3,;
[0047]沈QIDNo. 11 :5, -ATTACTGAAGCTGATTGCGC-3,。
[0048] 其中,更優選地,針對16SrRNA基因設計的引物序列連接Tag序列后為:
[0049] 5, -GTACGACTCACTATAGGGACTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3,;
[0050] 5' -AGGTGACACTATAGAATAATTACTGAAGCTGATTGCGC-3,。
[0051] 在本發明的一種優選實施例中,所述試劑盒還可W包括如下試劑中的任意一種或 幾種:緩沖液、DNA聚合酶、巧光標記物、dNTPs、DNA聚合酶激活劑。
[0052] 其中,所述DNA聚合酶可W是大腸桿菌DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚 合酶中的任意一種或幾種,并優選為化qDNA聚合酶。
[0053] 其中,所述DNA聚合酶激活劑優選為能夠提供Mg2+的物質,如氯化儀。
[0054] 本發明第二個方面是提供一種幽口螺桿菌抗生素耐藥性檢測方法,包括:
[0055] 提取幽口螺桿菌核酸;
[0056] 采用本發明第一個方面所述試劑盒對所提取的核酸中的抗生素耐藥相關基因進 行多重PCR擴增;
[0057] 毛細管電泳檢測。
[0058] 其中,所述PCR擴增反應過程中,同時使用所述試劑盒中針對每一種抗生素耐藥 基因設計的引物。
[0059] 其中,所述PCR擴增反應過程包括:
[0060] 105°C熱蓋預處理;
[0061] 95°C變性 2min;
[0062] 94°C變性30s,58°C退火30s,70°C延伸Imin ;該步驟進行33次循環;
[006引反應結束。
[0064] 本發明所述基于多基因的幽口螺桿菌抗生素耐藥性檢測方法,優選為非疾病診斷 和治療為目的的方法。
[0065] 其中,所述基于多基因的幽口螺桿菌抗生素耐藥性檢測方法,可W應用于藥物的 研發和/或篩選。
[0066] 本發明上下文內容中,所述耐藥優選為對大環內醋類藥物、和/或硝基巧喃類藥 物、和/或哇諾酬類藥物耐藥。
[0067] 其中,所述大環內醋類藥物優選為克拉霉素等。
[0068] 其中,所述硝基巧喃類藥物優選為巧喃挫酬等。
[0069] 其中,所述哇諾酬類藥物優選為左氧氣沙星等。
[0070]本發明上下文內容中,沒有特別說明的情況下,核巧酸序列中R代表核巧酸A或G, Υ代表核巧酸c或Τ/υ,D代表核巧酸A或G或Τ/υ。
[0071] 本發明基于多重基因分析,各診斷基因獨立分明,能夠實現在同一個反應體系內 實現對幽口螺桿菌的快速鑒定及多種抗生素耐藥性的分析,靈敏度可達到90%W上,準確 率也可W達到90 %,避免傳統培養方法和藥敏檢測耗時長、陽性率低、費用高等缺點。
【附圖說明】
[0072] 圖1為采用本發明試劑盒和方法檢測標準菌株ATCC26695的毛細管電泳圖;
[0073]圖2為采用本發明試劑盒和方法檢測臨床Η. pylori菌株的毛細管電泳圖;
[0074] 圖3為采用本發明試劑盒和方法檢測另一種臨床H.pylori菌株的毛細管電泳圖。
【具體實施方式】
[00巧] L材料
[0076] 1. 1.研究對象
[0077]H.pylori標準菌株(ATCC26695)、兩種分離的H.pylori臨床菌株。
[0078] L 2.材料巧試劑
[0079] GoTaqDNA堤合峭 巧WPromega公-uj SampleLoadingSolution 巧邑eckmanCoulter公 DNAsi巧standard40日marker 巧ii;;lBeckmanCou帖r公d GenomeLabSeparationBuffer 關!i;l邑eckmanCoulter公-d 10ObpDNALa加er 人選Takara公-!ij 礦物她 美國BeckmanCoulter'公-iij 細菌基因組DNA抽提試劑盒 北京天根公司 100bpDNALadder 人連Taka巧公i'j 邑iowesiagarose 、;J.、i.邑iowesi公, 10mm細蘭培養皿